沈碩

摘要：為研制辣椒疫霉病新型殺菌劑，測定了1株活性中度嗜鹽菌發(fā)酵液的提取物對辣椒疫霉菌的抑制作用及抑制中濃度。結(jié)果表明，在2、1 mg/mL的供試濃度下，菌株E0102B1發(fā)酵產(chǎn)物的水溶性部分對辣椒疫霉菌的抑制率最高，為79.45%；總粗提物部分抑制率為66.92%。通過回歸方程計算對辣椒疫霉菌的抑制中濃度值（EC50）為1.09 mg/mL。

關(guān)鍵詞：中度嗜鹽菌；提取物；辣椒疫霉菌；抑菌活性；生物防治

中圖分類號： S436.48.1+9 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0170-02

嗜鹽菌是極端環(huán)境微生物的重要類群之一，作為重要的鹽田生物，更作為一種新型微生物資源，它不僅為微生物生理、遺傳和分類及生命科學(xué)和相關(guān)學(xué)科許多領(lǐng)域的研究提供新的課題，也為生物進化、生命起源的研究提供新的材料，展現(xiàn)了它潛在而廣闊的應(yīng)用前景[1]。目前，有關(guān)嗜鹽菌的研究報道主要涉及到新菌種的發(fā)現(xiàn)、多相分類學(xué)的鑒定及菌株同源進化關(guān)系等方面[2-6]，但針對嗜鹽菌的生物活性及其應(yīng)用開發(fā)方面的研究較少。

青海省境內(nèi)有大面積的鹽湖，是研究鹽堿環(huán)境微生物資源的理想場所。近年來，研究人員對青海省柯柯鹽湖[7]、茶卡鹽湖[7-9]、青海湖[10]等鹽湖區(qū)域中的微生物資源進行了一系列研究，從中發(fā)現(xiàn)了較多的嗜鹽細(xì)菌和放線菌等微生物新類群，并篩選出了一批具有較強生物活性的菌株，分析了該地區(qū)嗜鹽微生物資源的多樣性，為我國西北鹽堿環(huán)境中微生物資源的利用與保護打下了基礎(chǔ)。

從鹽湖極端環(huán)境中生長的各種微生物，必然會產(chǎn)生一些獨特的次級代謝產(chǎn)物，從中分離到新穎結(jié)構(gòu)及新活性的化合物的概率也會大大增加，將研究得到的化合物應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及醫(yī)藥方面，必將開發(fā)出一系列新型農(nóng)藥制劑的先導(dǎo)化合物或抗腫瘤臨床用藥的先導(dǎo)化合物，具有一定的理論及實踐意義[11]。

本試驗以本研究小組之前篩選出的具有抑制辣椒疫霉菌活性的嗜鹽菌菌株為靶標(biāo)菌，對其次級代謝產(chǎn)物粗提物開展進一步的活性追蹤試驗，研究粗提物抑制辣椒疫霉活性的活性部位，為下一步開展活性菌株田間試驗及分離活性化合物、開發(fā)新型生物活性農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 供試活性嗜鹽菌菌株E0102B1由本實驗室分離自察爾汗鹽湖湖泥樣品，辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）為青藏高原生物技術(shù)教育部重點實驗室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基 嗜鹽菌培養(yǎng)基為ATCC213改良培養(yǎng)基[12]：MgSO4·7H2O 10 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，KCl 5 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏10 g，NaCl 150 g，瓊脂粉12 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH值7.2～7.4。病原真菌培養(yǎng)基及對峙培養(yǎng)培養(yǎng)基均為馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）[13]：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.2 菌株發(fā)酵產(chǎn)物水溶性提取物的制備

將活性菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于搖瓶柜中28 ℃培養(yǎng)7 d后，按一定的比例加入甲醇浸泡5 d，取液體部分于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，得到浸膏A。向浸膏A中加入等體積的蒸餾水使其充分溶解，不溶于水的部分即脂溶性部分，溶于水的部分過濾后，經(jīng)D-101大孔樹脂柱蒸餾水洗脫，取液體部分于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，得到的浸膏為大分子部分。繼續(xù)經(jīng)甲醇洗脫后，取液體部分于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，得到的浸膏為水溶性部分。浸膏A中不溶于水的部分即為脂溶性部分。

1.3 水溶性提取物對辣椒疫霉菌抑制活性的測定

采用濾紙片法[14]，將菌餅及含有不同濃度水溶性提取物溶液的濾紙片分別移植到培養(yǎng)基平板上，置于培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，試驗設(shè)置3個重復(fù)。每天以十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值，根據(jù)下式計算抑制生長率：抑制率=（對照抑菌圈直徑-處理抑菌圈直徑）/對照抑菌圈直徑×100%。

1.4 水溶性提取物抑制辣椒疫霉菌的中濃度（EC50）

采用濾紙片法，即用5 mm直徑的打孔器在培養(yǎng)好的各植物病原真菌菌落外緣切下菌餅。將濾紙片分別蘸取終濃度為2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL的水溶性提取物溶液。根據(jù)統(tǒng)計回歸方法計算菌株發(fā)酵產(chǎn)物水溶性提取物對植物病原真菌的抑制中濃度值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物提取物抑制辣椒疫霉菌的活性

為了進一步確定發(fā)酵產(chǎn)物粗提物的活性部位，在2、1 mg/mL的供試濃度下，利用生長速率法測定了菌株E0102B1發(fā)酵產(chǎn)物粗提物的各個部分抑制辣椒疫霉菌的活性，粗提物各部分見圖1。從表1可以看出，粗提物3個部分中，水溶性部分對辣椒疫霉菌的抑制率最高，為79.45%；高于總粗提物部分的抑制率，總粗提物抑制率為66.92%。大分子部分的抑制活性較低。因此，將水溶性部分確定為菌株E0102B1發(fā)酵產(chǎn)物粗提物的活性部位。

2.2 活性菌株水溶性提取物抑制辣椒疫霉菌的中濃度

對活性較高的水溶性提取物部分，通過對起始濃度進行倍比稀釋為5個濃度梯度，在2.000、1.000、0.500、0250、0125 mg/mL的濃度下，菌株E0102B1的水溶性提取物對辣椒疫霉菌的抑制率分別為79.45%、48.62%、3521%、2183%、11.05%。對其建立濃度對數(shù)值-抑制率曲線，通過回歸方程計算其對辣椒疫霉菌的抑制中濃度值為 1.09 mg/mL （圖2、圖3）。

3 討論

菌株E0102B1粗提物各部分抑制辣椒疫霉菌的活性結(jié)果表明，菌株E0102B1的水溶性提取物對辣椒疫霉菌抑制率高于總粗提物的抑制率，說明該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物抑制辣椒疫霉菌的活性部位主要存在于水溶性提取物部分。今后可以做田間試驗以進一步開發(fā)利用。endprint

現(xiàn)有的抗菌藥物的不足之處在于抗菌譜普遍較窄。我們將對本研究中的抑菌活性較好的活性部分進行更深入的抗菌譜方面的研究，同時結(jié)合天然產(chǎn)物化學(xué)的手段，希望從中找出相關(guān)新的具有廣譜抗菌活性的物質(zhì)，為以后的抗菌機制研究、新型農(nóng)藥制劑開發(fā)與農(nóng)業(yè)綜合防治等方面打下基礎(chǔ)。

鹽湖中的生物多樣性蘊藏著重要的經(jīng)濟效益和巨大而特

殊的基因資源，也是我們需要探究的對象。鹽湖中新物種客觀存在，有待去發(fā)現(xiàn)與挖掘。開展鹽湖生物基因工程研究是現(xiàn)代生物技術(shù)的關(guān)注點；探索鹽湖微生物資源效能及應(yīng)用價值很有潛力，并具有廣闊的開發(fā)前景。

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