劉立李代禧郭柏松潘琦余華星柴培劉寶林楊春生

（1上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093；2上海東富龍科技股份有限公司 上海 201108）

LEA蛋白特征片段及海藻糖對(duì)熱敏性蛋白藥物胰島素凍干的協(xié)同保護(hù)

劉立1李代禧1郭柏松2潘琦1余華星1柴培1劉寶林1楊春生2

（1上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093；2上海東富龍科技股份有限公司 上海 201108）

熱敏性蛋白藥物胰島素的熱穩(wěn)定性較差，極易受制備方式和保存條件等影響而失活。故本研究分別利用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定凍干樣品中胰島素的效價(jià)和差示掃描量熱儀（DSC）測(cè)定凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度等重要參數(shù)，來(lái)研究胚胎發(fā)育晚期富集蛋白特征片段（LEA?motif，LEAM）和海藻糖凍干保護(hù)劑對(duì)胰島素凍干保護(hù)效果的影響。凍干實(shí)驗(yàn)表明，兩種保護(hù)劑均對(duì)胰島素的活性具有保護(hù)效果，且LEAM的活性保護(hù)效果優(yōu)于海藻糖。在效價(jià)和熱穩(wěn)定性方面，LEAM保護(hù)的胰島素凍干品均高于海藻糖保護(hù)的胰島素凍干樣品。更為重要的是，兩種保護(hù)劑協(xié)同保護(hù)時(shí)，少量海藻糖對(duì)于LEAM的保護(hù)特性具有增效作用。在凍干過(guò)程中，可有效提升藥物玻璃態(tài)的穩(wěn)定性，防止熱致變性失活。由此可見(jiàn)，這種LEAM和海藻糖保護(hù)劑復(fù)合保護(hù)方法有望也可以應(yīng)用在熱敏性蛋白藥物凍干粉針制備過(guò)程以保護(hù)藥物活性。

LEA蛋白特征片段；胰島素；海藻糖；冷凍干燥；活性保護(hù)

胰島素（Insulin）是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的蛋白質(zhì)激素。人體內(nèi)缺乏胰島素會(huì)導(dǎo)致高血糖，引發(fā)糖尿?。?］，故常用胰島素來(lái)治療糖尿病。胰島素的傳統(tǒng)給藥方式為皮下注射法。此外，肺部吸入給藥也是比較可行的非注射給藥途徑［2］。Alkenmes公司與Lilly公司聯(lián)合研制了AIR系統(tǒng)。AIR給藥裝置是呼吸促發(fā)型被動(dòng)裝置［3］。由于吸入型胰島素主要采用真空冷凍干燥的方式制備，為防止熱敏性蛋白藥物胰島素失活，制備凍干粉劑時(shí)常加入輔料［4］（如糖類，氨基酸和脂類），但收效甚微，藥品活性仍有較大損失，且儲(chǔ)存穩(wěn)定性較差。因此，迫切需要尋求一種行之有效的保護(hù)劑，在凍干過(guò)程中不僅保護(hù)胰島素活性，而且提升藥物的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。由于含有LEA蛋白的生物能夠迅速適應(yīng)高溫或低溫導(dǎo)致的極度缺水環(huán)境［5－10］，故本文選取線蟲(chóng)中第三組 LEA蛋白中的AavLEA1蛋白的K47?E57的11個(gè)氨基酸的特征重復(fù)片段（LEA?motif，LEAM）作為保護(hù)劑［11］。

效價(jià)是生物制品活性（數(shù)量）高低的標(biāo)志，可用來(lái)表征生物制品的活性。最初對(duì)胰島素活性的測(cè)定基本采用小鼠生物活性效價(jià)檢定法。由于此方法個(gè)體差異大、耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣，而高效液相色譜法操作簡(jiǎn)便、測(cè)量精密度高，故美國(guó)、英國(guó)藥典近來(lái)均將高效液相色譜法測(cè)定效價(jià)納入胰島素的效價(jià)測(cè)定方法［12］。因此，本文選用高效液相色譜法（High per?formance liquid chromatograph，HPLC）測(cè)定效價(jià)，研究LEAM和海藻糖對(duì)胰島素的協(xié)同保護(hù)作用。首先，利用HPLC測(cè)定胰島素效價(jià)，分析不同保護(hù)劑配比對(duì)胰島素凍干活性保護(hù)效果，再利用差示掃描量熱儀（Differential scanning calorimetry，DSC）測(cè)定凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、熱焓松弛峰溫和熱焓松弛焓值，分析不同保護(hù)劑配比對(duì)凍干品熱穩(wěn)定性的影響，最終研究LEAM和海藻糖對(duì)胰島素的協(xié)同保護(hù)機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料和儀器

豬胰島素標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)：140720?200901，中國(guó)藥品生物制品檢定所。豬胰島素，批號(hào)：1306A04，徐州萬(wàn)邦金橋制藥有限公司，白色結(jié)晶性干粉，按干燥品計(jì)，每1 mg供試品的效價(jià)為28.3 IU。LEA蛋白特征重復(fù)片段，批號(hào)：LT130325，北京澤溪源生物科技有限公司，白色干粉，純度＞95%。海藻糖（Trehalose）為二水海藻糖，批號(hào)：061027，上海源聚生物科技有限公司，純度＞98%。鹽酸（Hydrochloric acid），批號(hào)：20091102，湖南爾康制藥有限公司，分析純。無(wú)水硫酸鈉（Sodium sulfate anhydrous），批號(hào)：20130830，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司，為分析純。乙醇胺（Mo?noethanolamine），批號(hào)：20130228，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司，為分析純。磷酸（Phosphoric acid），批號(hào)：20120618，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司，為分析純。乙腈（Acetonitrile）為色譜純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

凍干機(jī)采用LYO?0.2型凍干機(jī)，上海東富龍科技股份有限公司。高效液相色譜儀由Waters e2695分離模塊和Waters 2998光電二極管檢測(cè)器組成，美國(guó)Waters公司。差示掃描量熱儀為DSC1，瑞士Mett?ler?Toledo公司?？栙M(fèi)休滴定儀采用Mettler Toledo DL38卡爾費(fèi)休滴定儀，瑞士Mettler?Toledo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胰島素保護(hù)劑溶液的配制

首先，配制成50 mL 4.2 mg／mL的豬胰島素溶液。再分別按照胰島素和保護(hù)劑不同的質(zhì)量比，加入適量保護(hù)劑，最后分裝成1 mL的溶液凍干。根據(jù)胰島素和保護(hù)劑的相關(guān)配比依次分成四組，具體數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)中所用溶液均現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 胰島素和保護(hù)劑配比Tab.1 The ratio of insu lin and p rotectant

1.2.2 樣品的凍干

樣品首先預(yù)凍至－45℃，持續(xù)1 h，一次干燥至－35℃，持續(xù)18 h，二次干燥至25℃，持續(xù)6 h，真空度為10 Pa［13］。凍干結(jié)束后，樣品無(wú)塌陷。樣品凍干完成后，利用卡爾費(fèi)休滴定儀，測(cè)定凍干干粉的水分含量，水分含量均在3%左右。

1.2.3 HPLC測(cè)定胰島素效價(jià)

胰島素的效價(jià)測(cè)定利用反相色譜技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。色譜柱采用XBridge C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；以0.2 mol／L硫酸鹽緩沖液（取無(wú)水硫酸鈉28.4 g，加水溶解后，加磷酸2.7 mL，乙醇胺調(diào)節(jié)pH值至2.3，加水至1000 mL）?乙腈（74：26）為流動(dòng)相；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。每次取樣20 uL，按照外標(biāo)法獲得效價(jià)。凍干后樣品，均用等體積超純水復(fù)溶后測(cè)定。

1.2.4 DSC測(cè)定熱穩(wěn)定性

溫度和熱熔標(biāo)定采用標(biāo)樣銦和鋅的熔融過(guò)程（均采用外推起始溫度）進(jìn)行兩點(diǎn)標(biāo)定。標(biāo)定速率為10℃／min，液氮冷卻采用Cryofab公司的液氮容器控制。樣品沖洗氣體為高純度氮?dú)猓兌龋?9.999%），流量20 mL／min保持不變。樣品量為5～10 mg，精確到±0.01 mg。天平采用梅特勒?托利多的XS205，精確到0.01 mg。樣品皿為40 uL標(biāo)準(zhǔn)液體鋁皿（上海笛柏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），用液固通用壓機(jī)（瑞士Mettler?Toledo公司）壓制。

表2 加入不同保護(hù)劑后凍干品外觀檢測(cè)結(jié)果Tab.2 The appearance of lyophilized insulin with different protectant

本實(shí)驗(yàn)的測(cè)量溫度范圍為25～165℃。設(shè)定的實(shí)驗(yàn)程序?yàn)閺?5℃開(kāi)始，以5℃／min的升溫速率升溫至165℃。玻璃化轉(zhuǎn)變溫度采用熱分析軟件STAReSoftware（瑞士 Mettler?Toledo公司，12.00版本）。取發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變的中點(diǎn)溫度為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，取熱焓松弛峰處的溫度為熱焓松弛峰溫，取熱焓松弛峰面積為熱焓松弛焓值。

2 結(jié)果與討論

2.1 凍干樣品外觀表征

胰島素凍干的參照樣品和第1組LEAM保護(hù)的胰島素凍干樣品的外觀均為白色疏絮狀，帶有裂縫。而第2組海藻糖保護(hù)胰島素凍干樣品的外觀具有一定差異性，當(dāng)胰島素和海藻糖的質(zhì)量比在1：1和1：2時(shí)，海藻糖保護(hù)的胰島素凍干樣品內(nèi)有些許裂縫，但當(dāng)胰島素和海藻糖的質(zhì)量比在1：3以上時(shí)，海藻糖保護(hù)的胰島素凍干樣品內(nèi)的裂縫消失，外觀為白色絮狀物，外形完整。同時(shí)，第3組和第4組LEAM和海藻糖協(xié)同保護(hù)的胰島素凍干樣品的裂縫較LEAM保護(hù)的胰島素凍干樣品少。因此，海藻糖在外觀方面還可起賦形劑的作用。

2.2 保護(hù)劑對(duì)胰島素凍干樣品效價(jià)影響

圖1為胰島素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的液相色譜圖。圖3 （c），3（e）和3（f）中的LEAM峰，胰島素峰和A?21脫酰胺峰均較好分離。由于糖類的分子量較小，利用反相色譜技術(shù)不能較好捕獲，因此圖3（d），3（e）和3 （f）上僅有胰島素峰、A?21脫酰胺胰島素峰及LEAM峰，無(wú)海藻糖峰。所有A?21脫酰胺峰的峰面積所占比例均小于5%，符合藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)［14］。

圖1 胰島素標(biāo)準(zhǔn)品曲線Fig.1 The HPLC curve of insulin standard solution

圖2 單一及協(xié)同保護(hù)劑保護(hù)的凍干品中胰島素效價(jià)減少量Fig.2 Proficiency decrement of lyophilized insulin w ithin only LEAM／trehalose and synergistical LEAM and trehalose

圖2為凍干前后不同質(zhì)量LEAM或海藻糖保護(hù)下胰島素的效價(jià)減少量對(duì)比柱形圖。發(fā)現(xiàn)未加任何保護(hù)劑凍干參照樣品，胰島素的效價(jià)從凍干前的46.50 IU／mL降低至凍干后的38.57 IU／mL，效價(jià)減少7.93 IU／mL，說(shuō)明凍干會(huì)造成胰島素的效價(jià)下降，易使藥物失去活性。而第1組LEAM保護(hù)的凍干樣品中胰島素效價(jià)減少量約為1.69～2.25 IU／mL，且當(dāng)胰島素和LEAM的質(zhì)量比1：7時(shí)，胰島素效價(jià)減少量最小，凍干保護(hù)效果相對(duì)其他濃度的胰島素?LEAM凍干品而言較優(yōu)。第2組海藻糖保護(hù)的凍干樣品中胰島素效價(jià)減少量約為3.28～6.39 IU／mL，當(dāng)胰島素和海藻糖的質(zhì)量比為1：5時(shí)，胰島素效價(jià)減少量最小，凍干保護(hù)效果相對(duì)較優(yōu)。

圖3 胰島素溶液及相關(guān)凍干樣品的高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography images

添加保護(hù)劑的胰島素凍干樣品效價(jià)減少量均低于未添加保護(hù)劑的胰島素凍干樣品效價(jià)減少量，說(shuō)明LEAM和海藻糖均對(duì)胰島素的凍干具有活性保護(hù)作用，能有效防止胰島素由于凍干而引起的失活，且LEAM比海藻糖對(duì)胰島素的凍干保護(hù)效果更好。

圖2還表明了LEAM和海藻糖對(duì)胰島素協(xié)同保護(hù)效果。第3組胰島素樣品中同時(shí)添加不同質(zhì)量比的LEAM和海藻糖做凍干活性保護(hù)劑時(shí)，在相同條件下凍干，發(fā)現(xiàn)該凍干樣品中胰島素效價(jià)減少量?jī)H為0.14～1.80 IU／mL，說(shuō)明在LEAM中加入一定量的海藻糖后，能更好保護(hù)胰島素的生物活性。因此，LEAM和海藻糖對(duì)凍干過(guò)程中的胰島素起協(xié)同保護(hù)作用。當(dāng)LEAM和海藻糖復(fù)合保護(hù)的凍干樣品中胰島素和海藻糖質(zhì)量比為1：1時(shí)，凍干樣品中胰島素效價(jià)減少量隨著LEAM加入量的增大而減小，即隨著LEAM加入量的增大，凍干保護(hù)效果更優(yōu)。胰島素和LEAM的比例為1：5時(shí)，凍干保護(hù)效果達(dá)到相對(duì)最佳。

第4組復(fù)合保護(hù)的凍干樣品組中的海藻糖的質(zhì)量比提高1倍。凍干效價(jià)減少量表明胰島素和LEAM質(zhì)量比為1：1和1：3時(shí)的凍干樣品的胰島素效價(jià)減少量均比第3組復(fù)合保護(hù)的凍干樣品效價(jià)減少量小；當(dāng)胰島素和LEAM質(zhì)量比提高到1：5和1：7時(shí)，復(fù)合保護(hù)凍干樣品的效價(jià)減少量又均比第3組胰島素凍干樣品的效價(jià)減少量大，但依然比前兩組的保護(hù)效果好。這說(shuō)明加入少量海藻糖對(duì)提升胰島素和LEAM的協(xié)同保護(hù)效果更好。因?yàn)榇罅亢Ｔ逄堑拇嬖诳赡軙?huì)影響LEAM在胰島素蛋白表面的吸附作用，導(dǎo)致LEAM吸附保護(hù)作用減弱。

根據(jù)水替代假說(shuō)［15］，在干燥過(guò)程中，隨著水分子的缺失，高親水性的LEAM會(huì)穩(wěn)定吸附在胰島素蛋白表面，形成保護(hù)層，保護(hù)胰島素不因缺水而受到傷害。但因分子較大，不能完全占據(jù)整個(gè)胰島蛋白分子表面，加入海藻糖后，小分子的海藻糖可以有效彌補(bǔ)這種缺陷，在胰島素表面協(xié)同作用，有效形成一種復(fù)合保護(hù)層。當(dāng)海藻糖數(shù)量較多時(shí)，胰島蛋白表面大部分被海藻糖占據(jù)，盡管海藻糖不易結(jié)晶，而是形成玻璃態(tài)，也有保護(hù)作用［16］，但是LEAM被逐漸隔離開(kāi)來(lái)，故保護(hù)效果又有明顯下降。

2.3 凍干樣品的DSC熱分析

藥物凍干后，原來(lái)的水溶劑環(huán)境消失，溶劑化穩(wěn)定作用也消失，干燥的無(wú)水環(huán)境打破了蛋白質(zhì)表面基團(tuán)間作用力的平衡，藥物活性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性逐漸變差。而加入保護(hù)劑后，保護(hù)劑在藥物蛋白表面的吸附作用，可以部分替代水溶劑環(huán)境，維持蛋白質(zhì)活性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。為了研究不同保護(hù)劑及其配比對(duì)胰島素蛋白的穩(wěn)定作用，本文利用差示掃描量熱儀，測(cè)定凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、熱焓松弛峰溫和熱焓松弛焓值，分析各保護(hù)劑對(duì)蛋白藥物的保護(hù)效果及整體熱穩(wěn)定性。

圖4（a）所示為胰島素的DSC曲線、圖4（b）所示為L(zhǎng)EAM保護(hù)劑的DSC曲線、圖4（c）所示為海藻糖保護(hù)劑的DSC曲線。觀察圖4（c）發(fā)現(xiàn)，海藻糖的DSC曲線，在98.47℃有一個(gè)明顯的吸熱峰，同時(shí)文獻(xiàn)［17］中指出二水海藻糖的熔融溫度為97℃，該吸熱峰溫度與文獻(xiàn)中所列溫度較一致，故本實(shí)驗(yàn)所用海藻糖的熔融峰的峰溫為98.47℃±0.59℃。而除圖4（c）外，其它樣品的DSC曲線的玻璃化轉(zhuǎn)變區(qū)域的高溫側(cè)均有一個(gè)吸熱峰，這是由于結(jié)構(gòu)松弛引起的焓恢復(fù)過(guò)程，即從高能非平衡玻璃態(tài)向平衡態(tài)松弛的過(guò)程，故胰島素干粉和LEAM干粉發(fā)生了伴隨熱焓松弛的玻璃化轉(zhuǎn)變。同時(shí)，進(jìn)一步觀察加入不同劑量配比保護(hù)劑后凍干樣品的DSC曲線（圖5）發(fā)現(xiàn)，加有保護(hù)劑的凍干樣品也均發(fā)生伴隨熱焓松弛的玻璃化轉(zhuǎn)變。

表3所示為不同保護(hù)劑含量下凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、熱焓松弛峰溫和熱焓值。分析表3中的數(shù)據(jù)可知，第1組實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)LEAM作為保護(hù)劑時(shí)，且胰島素和LEAM的質(zhì)量比為1：1時(shí)，該凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度比胰島素干粉的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度僅高出0.53℃，同時(shí)該凍干樣品的熱焓松弛峰溫低于胰島素干粉的熱焓松弛峰溫，說(shuō)明單純加入較低劑量LEAM保護(hù)劑對(duì)凍干樣品熱穩(wěn)定性的提升影響較小，凍干樣品熱穩(wěn)定性仍較差，較易發(fā)生分解。但隨著LEAM加入量的增大，凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和熱焓松弛峰溫均隨著LEAM的增加而增大，說(shuō)明隨著LEAM的增加，凍干樣品在更高溫度發(fā)生相變，熱穩(wěn)定性得到提高。文獻(xiàn)［18］中指出10%和20%的海藻糖溶液凍干品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度分別為35.3℃和36.6℃。而LEAM粉末的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為134.58℃，LEAM粉末的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于海藻糖凍干品。因此，第1組LEAM保護(hù)的胰島素凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和熱焓松弛峰溫均高于第2組海藻糖保護(hù)的胰島素凍干樣品，說(shuō)明LEAM保護(hù)效果更好，可更大程度上提升凍干樣品的熱穩(wěn)定性。

在第3組兩種保護(hù)劑復(fù)合保護(hù)胰島素的DSC實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合保護(hù)的凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度分別較第1組凍干樣品提升1.31℃、0.3℃、0.09℃和8.11℃。第4組復(fù)合保護(hù)胰島素凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（除第4組第1個(gè)凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度降低外）分別比第1組凍干樣品提升0.53℃、2.87℃和8.83℃。說(shuō)明除胰島素?LEAM?海藻糖質(zhì)量比為1：1：2的凍干樣品外，兩種保護(hù)劑協(xié)同作用后，對(duì)凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度均有提升，即協(xié)同保護(hù)的凍干樣品的熱穩(wěn)定性提升。

第3組和第4組凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，均隨著LEAM和海藻糖加入量的增大而增大。觀察所有兩組凍干樣品的熱焓松弛峰溫，發(fā)現(xiàn)兩種保護(hù)劑協(xié)同作用后的所有凍干樣品（除胰島素?LEAM?海藻糖質(zhì)量比為1：1：2凍干樣品外）的熱焓松弛峰溫均比第1組LEAM保護(hù)的凍干樣品低。原因可能是由于海藻糖在98.47℃附近即發(fā)生熔融，故復(fù)合保護(hù)的凍干樣品的熱焓松弛峰溫均比第1組LEAM保護(hù)的凍干樣品低。

比較復(fù)合保護(hù)的凍干樣品和第1組凍干樣品的熱焓松弛焓值，發(fā)現(xiàn)除胰島素?LEAM?海藻糖質(zhì)量比為1：1：2的凍干樣品外，其余復(fù)合保護(hù)的凍干樣品的熱焓松弛焓值均低于相應(yīng)的第1組凍干樣品的熱焓松弛焓值，且隨著海藻糖的增加，凍干樣品的熱焓松弛焓值降低。這說(shuō)明LEAM和少量海藻糖協(xié)同保護(hù)的凍干樣品，較相應(yīng)的LEAM保護(hù)胰島素凍干樣品而言，更難發(fā)生從玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化為結(jié)晶態(tài)的焓松弛。其原因可能是干燥誘導(dǎo)LEAM較好地貼合在胰島素蛋白的外面，穩(wěn)固了胰島素蛋白的穩(wěn)定性，而加入少量海藻糖后，提升了玻璃體的強(qiáng)度，從而提升凍干樣品的熱穩(wěn)定性。

表3 不同保護(hù)劑含量下凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，熱焓松弛峰溫和熱焓松弛焓值Tab.3 Variation of Tg，Tmaxand ΔH of lyophilized products with different mass of protectant

圖4 胰島素及LEAM、海藻糖保護(hù)劑的DSC曲線Fig.4 DSC curves of insulin and protectant LEAM and trehalose

而當(dāng)胰島素、LEAM和海藻糖的質(zhì)量比為1：1：2時(shí)，該凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較單一胰島素的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度低，該樣品的DSC曲線的峰型與第2組海藻糖保護(hù)的胰島素凍干樣品的DSC曲線峰型具有較高一致性，其原因可能是由于該凍干樣品中海藻糖含量較高，而海藻糖凍干品具有較低的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，該體系的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較低。

3 結(jié)論

本研究分別利用高效液相色譜測(cè)定胰島素效價(jià)和差示掃描量熱儀測(cè)定凍干樣品玻璃化轉(zhuǎn)變溫度等方法，以研究LEAM和海藻糖及其二者協(xié)同作用對(duì)熱敏性蛋白藥物胰島素的凍干保護(hù)效果和熱穩(wěn)定性的影響。

圖5 LEAM和海藻糖分別保護(hù)的凍干樣品及LEAM和海藻糖協(xié)同保護(hù)凍干樣品DSC曲線圖Fig.5 DSC curves of lyophilized insulin?LEAM，insulin?trehalose and synergistic LEAM and trehalose with insulin products

LEAM或海藻糖均對(duì)熱敏性蛋白藥物胰島素具有一定保護(hù)效果，且LEAM的保護(hù)效果優(yōu)于海藻糖。LEAM保護(hù)的胰島素凍干樣品的熱穩(wěn)定性也高于海藻糖保護(hù)的胰島素凍干樣品。因此，LEAM是一種優(yōu)良的凍干活性保護(hù)劑。

兩種保護(hù)劑復(fù)合保護(hù)時(shí)，少量海藻糖對(duì)于LEAM的保護(hù)特性具有協(xié)同增效的作用，但隨著海藻糖的增加，對(duì)凍干協(xié)同保護(hù)效果的提升不明顯。DSC測(cè)定結(jié)果則顯示，兩種保護(hù)劑協(xié)同作用不僅可有效提高凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，還提升了凍干樣品的玻璃體強(qiáng)度，增加了凍干樣品的熱穩(wěn)定性。

兩種保護(hù)劑復(fù)合保護(hù)時(shí)，最佳的配比是胰島素?LEAM?海藻糖質(zhì)量比為1：1：2～1：3：2。

本文受上海市“創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”國(guó)際科技合作項(xiàng)目（12430702000），上海市重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目（T0503和 P0502），上海市自然科學(xué)基金（12ZR1420400），上海市教委科研創(chuàng)新項(xiàng)目（14YZ092）和上海市聯(lián)盟計(jì)劃項(xiàng)目資助。（The project was supported by the Innovation Foundation for International Coopera?tion of the Shanghai Committee of Science and Technology（No. 12430702000），Key Disciplines Program of Shanghai（No.T0503 ＆No.P0502），the Natural Science Foundation of Shanghai（No. 12ZR1420400），Innovation Program of Shanghai Municipal Edu?cation Commission（No.14YZ092）and Alliance Program in Shanghai.）

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李代禧，男，博士，碩士生導(dǎo)師，副教授，上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，（021）55271117，E?mail：dxli75＠126.com。研究方向：計(jì)算生物學(xué)和低溫生物熱科學(xué)?，F(xiàn)在進(jìn)行的研究項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（51076108），上海市＂創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃＂國(guó)際科技合作項(xiàng)目（12430702000），上海市重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目（T0503和P0502），上海市自然科學(xué)基金（12ZR1420400），上海市教委科研創(chuàng)新項(xiàng)目（14YZ092）和上海市聯(lián)盟計(jì)劃項(xiàng)目。

About the corresponding author

Li Daixi，male，Ph.D.，master instructor，associate professor，Institue of Biothermal Science and Technology，University of Shanghai for Science and Technology，＋86 21－55271117，E?mail：dxli75＠126.com.Research fields：computational biology and cryobiology thermal science.The author takes on project sup?ported by the National Natural Science Fundation of China（No. 51076108），the Innovation Foundation for International Coopera?tion of the Shanghai Committee of Science and Technology（No. 12430702000），Key Disciplines Program of Shanghai（No.T0503 ＆No.P0502），the Natural Science Foundation of Shanghai（No. 12ZR1420400），Innovation Program of Shanghai Municipal Edu?cation Commission（No.14YZ092）and Alliance Program in Shanghai.

Synergistic Bioactive Protection of LEA?motif and Trehalose on Insulin during Freeze?drying

Liu Li1Li Daixi1Guo Baisong2Pan Qi1Yu Huaxing1Chai Pei1Liu Baolin1Yang Chunsheng2

（1.Institute of Biothermal Science and Technology，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai，200093，China；2.Shanghai Tofflon Science and Technology Co.，Ltd.，Shanghai，201108，China）

Water Due to the poor heat stability，insulin is easy to lose its bioactivity during storage.Bioactive protection of LEA?motif（LEAM）and trehalose towards insulin was investigated respectively and synergistically.High performance liquid chromatography method was used to study the proficiency of insulin and differential scanning calorimetry was used to study glass transition temperature.According to the re?sults，both LEAM and trehalose can protect the bioactivity of insulin.The protective effect of LEAM is better than that of trehalose.That is to say that the bioactivity proficiency and heat stability of insulin within LEAM are better than those of insulin within trehalose.It is in?teresting that adding a bit trehalose can enhance the bioactive protection effect of LEAM towards insulin.During lyophilization，synergistic bioactive protection of LEAM and trehalose can not only enhance the stability of insulin，but also protect insulin from thermal degenera?tion.So such synergistic bioprotectants can be used to maintain the bioactivity of heat sensitive protein during lyophilization.

LEA?motif；insulin；trehalose；lyophilization；protectant

R318.52；TQ025.3

A

0253－4339（2015）04－0111－08

10.3969／j.issn.0253－4339.2015.04.111

簡(jiǎn)介

國(guó)家自然科學(xué)基金（51076108）資助項(xiàng)目。（The project was supported by the National Natural Science Fundation of China（No. 51076108）.）

2014年12月8日