李浩飛

平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院藥劑科，河南平頂山467000

RP-HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定絞股藍(lán)中各成份含量

李浩飛

平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院藥劑科，河南平頂山467000

目的用RP-HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII的含量。方法采用Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5%醋酸(B)，梯度洗脫（0～5min，10%A；5～27min，10%～40%A，27.1min，10%A；27.1～30min，10%A），柱溫30℃，流速1.0mL/min，載氣為N2，體積流量2.0 L/min，霧化溫度42℃，漂移管溫度65℃，增益5。結(jié)果人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII在152.4～3048 ng（r=0.9996）、65.2～1304 ng（r=0.9998）、87.2～11744 ng（r=0.9998）、11.3～226 ng（r=0.9995）范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。平均回收率分別為100.05%、100.36%、100.82%、100.61%(n=9)，RSD分別為1.77%、2.17%、2.31%、2.65%。9批絞股藍(lán)樣品含量范圍：絞股藍(lán)皂苷A 6.92～22.63 mg/g，人參皂苷Rb1 0～11.23 mg/g，絞股藍(lán)皂苷XLIX 0～13.24 mg/g，七葉膽苷XVII 0～4.16 mg/g。結(jié)論該方法測(cè)定絞股藍(lán)中皂苷類成分含量靈敏、準(zhǔn)確，分離效果較好，無干擾，可為完善絞股藍(lán)中皂苷類成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

絞股藍(lán)；高效液相色譜法；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器

絞股藍(lán)，又稱天堂草、福音草、超人參、公羅鍋底、遍地生根、七葉膽、五葉參和七葉參等，是Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物[1-2]。絞股藍(lán)主要有效成份是絞股藍(lán)皂苷、絞股藍(lán)糖苷、水溶性氨基酸、黃酮類、多種維生素、微量元素、礦物質(zhì)等[2-3]，現(xiàn)代藥理研究表明[4-6]，絞股藍(lán)具有保護(hù)心腦血管、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、降血糖、調(diào)血脂、保肝、抗氧化、抗?jié)円约翱顾ダ系然钚?。絞股藍(lán)開發(fā)的力度較大，但對(duì)其全面的質(zhì)量控制還不夠完善。另外，目前對(duì)絞股藍(lán)中的人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII 5種成分同時(shí)測(cè)定的報(bào)道較少。因此，該文探討用RP-HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII的含量，旨在完善絞股藍(lán)的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；YQ-1000A型超聲清洗器（上海易凈超聲波儀器廠）；Sartorius BP211D分析天平（德國(guó)賽多利斯）；人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào)：110704-201122)，供HPLC含量測(cè)定用，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；絞股藍(lán)皂苷A對(duì)照品(批號(hào)：157752-0107)、絞股藍(lán)皂苷XLIX對(duì)照品(批號(hào)：13080202)、七葉膽苷XVII對(duì)照品(批號(hào)：13050301)，由成都成都曼思特生物科技有限公司提供。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；水為超純水；絞股藍(lán)藥材購(gòu)自全國(guó)不同地區(qū)，經(jīng)該院藥學(xué)部鑒定為葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII對(duì)照品適量，精密稱定，分別置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液，濃度分別為1.524mg/mL、1.304mg/mL、0.872mg/mL、0.565 mg/mL。精密量取各對(duì)照品溶液量瓶中，甲醇稀釋并定容，制成混合對(duì)照品溶液，濃度分別為：絞股藍(lán)皂苷A 152.4μg/mL、人參皂苷Rb165.2 μg/mL、絞股藍(lán)皂苷XLIX 87.2 μg/mL、七葉膽苷XVII 11.3 μg/mL，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取絞股藍(lán)粉末（過3號(hào)篩）0.1 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25mL，超聲處理（功率250 W，80 kHz）30min，過濾，濾液揮干，加水溶解，用水飽和正丁醇萃取至無色，合并萃取液，用氨試液洗滌2次，棄氨試液，減壓蒸干，用甲醇定容至10mL，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件

Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相：乙腈(A)-0.5%醋酸水(B)，梯度洗脫（0～5min，10% A；5～27min，10%～40%A，27.1min，10%A；27.1～30min，10%A），柱溫30℃，流速1.0mL/min，載氣為N2，體積流量2.0 L/min，霧化溫度42℃，漂移管溫度65℃，增益5。理論塔板數(shù)按絞股藍(lán)皂苷A峰計(jì)算不低于2000，見圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液（A）和供試品溶液（B）高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密吸取上述混合對(duì)照品溶液1μL、5μL、10μL、15μL、20μL，注入色譜儀，以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)為自變量，色譜峰面積的對(duì)數(shù)為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII在較大范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。

表1 線性回歸性分析

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，以各峰面積的對(duì)數(shù)分別計(jì)算，結(jié)果：絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII的RSD分別為1.64%、2.37%、2.36%、2.61%（n=5）。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取新制備的同一供試品溶液（浙江永嘉），于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣10μL進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示，絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII的含量分別為7.11mg/g、2.89 mg/g、2.41 mg/g、1.64 mg/g，RSD分別為1.76%、2.13%、2.45%、2.33%，結(jié)果表明樣品在12 h之內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（浙江永嘉），共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣體積10μL，以對(duì)數(shù)外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII的含量分別為7.02 mg/g、3.12 mg/g、2.48 mg/g、1.56mg/g，RSD分別為1.97%、2.25%、2.51%、2.14%（n=6）。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已經(jīng)測(cè)定含量的樣品（浙江永嘉）9份，每份約0.05 g，精密稱定，按照供試品測(cè)定的絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII含量，以其一半的100%比例精密加入單個(gè)儲(chǔ)備對(duì)照品溶液，再按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按色譜條件測(cè)定樣品，計(jì)算回收率，結(jié)果：絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII的回收率分別為100.05%、100.36%、100.82%、100.61%（n=9），見表2。

2.9 樣品含量測(cè)定

取所收集的9個(gè)不同來源絞股藍(lán)藥材，按照上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)數(shù)外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算絞股藍(lán)中成分的含量見表3。

表3 不同產(chǎn)地樣品測(cè)定結(jié)果[n=3，（mg/g）]

3 討論

絞股藍(lán)號(hào)稱“南方人參”，在中國(guó)主要分布在陜西平利、甘肅康縣、湖南、湖北，云南、廣西等省，民間稱其為神奇的“不老長(zhǎng)壽藥草”，1986年，國(guó)家科委在“星火計(jì)劃”中，把絞股藍(lán)列為待開發(fā)的“名貴中藥材”之首位，2002年國(guó)家衛(wèi)生部將其列入保健品名單[7]。絞股藍(lán)具有減肥、降血脂、調(diào)血壓、延緩衰老、預(yù)防冠心病、抑制癌細(xì)胞、調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能，絞股藍(lán)皂苷是其主要藥效成分[8-10]。人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII均為絞股藍(lán)中的皂苷類成分，文獻(xiàn)報(bào)道采用紫外檢測(cè)器測(cè)定絞股藍(lán)中的皂苷類成分，檢測(cè)波長(zhǎng)在203 nm[11-13]；單一對(duì)某一絞股藍(lán)中的皂苷類成分進(jìn)行測(cè)定，對(duì)多種絞股藍(lán)中的皂苷類成分同時(shí)測(cè)定較少。該實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法，結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，建立了絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII的測(cè)定方法，通過方法學(xué)考察，結(jié)果顯示該方法快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII的質(zhì)量控制方法

該實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相系統(tǒng)的考察中，對(duì)比乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲醇-水等流動(dòng)性系統(tǒng)，結(jié)果顯示乙腈-水系統(tǒng)效果較為理想，分離效果俱佳，且加入0.5%醋酸的乙腈-水系統(tǒng)后，峰形對(duì)稱性較好，對(duì)稱因子均在0.95～1.05之間，能完成對(duì)人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII的分離。因此，選擇乙腈-0.5%醋酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相。該文采用梯度洗脫，梯度變化比例簡(jiǎn)單，克服了梯度過于復(fù)雜，難以操作，避免梯度復(fù)雜而導(dǎo)致重復(fù)性較低和基線不穩(wěn)等現(xiàn)象出現(xiàn)，最終造成的是樣品組分含量難以得到保證。而該文中各峰均能達(dá)到基線分離，能較好對(duì)4種成分的定性和定量。該文采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器作為檢測(cè)器，由于這4種皂苷類成分紫外最大吸收波長(zhǎng)為203 nm左右，屬于吸收末端，采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，物質(zhì)相互間干擾較大，分離效果較差，而蒸發(fā)光散射檢測(cè)器可以避免這類情況發(fā)生。

在對(duì)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII的含量比較，結(jié)果顯示，絞股藍(lán)皂苷A 6.92～22.63 mg/g，人參皂苷Rb10～11.23 mg/g，絞股藍(lán)皂苷XLIX 0～13.24 mg/g，七葉膽苷XVII 0～4.16 mg/g，絞股藍(lán)中的人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII成分差異較大，這可能與產(chǎn)地的氣候、水土等環(huán)境因素有關(guān)，這不僅表現(xiàn)在成分種類差異，也表現(xiàn)在成分含量差異。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

綜上所述，該文建立了RP-HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX、七葉膽苷XVII的含量的方法，該方法測(cè)定絞股藍(lán)中皂苷類成分含量靈敏、準(zhǔn)確，分離效果較好，無干擾，可作為完善絞股藍(lán)中皂苷類成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

[1]Wu YC,Zhong ZG,Liu SL,et al.Protective effect of serum containing n-butanol fraction from Gynostemma pentaphyllum on NG108-15 cell apoptosis induced by Aβ25.35 protein[J]. Zhong Yao Cai,2014,37(6):1029-33.

[2]歐陽輝,田啟建,余佶,等.酶法輔助提取絞股藍(lán)中總黃酮工藝優(yōu)化[J].中草藥,2011,42(5):886-889.

[3]許澤龍,楊豐慶,夏之寧.絞股藍(lán)化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(8):1067-1069.

[4]史琳,趙紅,張璐雅,等.絞股藍(lán)藥理作用的研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2011(2):125-129.

[5]李杰,楊舟,詹琤琤.絞股藍(lán)化學(xué)成分與藥理作用研究概況[J].湖北中醫(yī)雜志,2012,34(10):74-76.

[6]朱廣東.中藥絞股藍(lán)的活性研究進(jìn)展[J].科技創(chuàng)新與應(yīng)用,2012(5):5.

[7]樸香蘭,吳倩.絞股藍(lán)研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(7): 1758-1760.

[8]Tsui KC,Chiang TH,Wang JS,et al.Flavonoids from Gynostemma pentaphyllum exhibit differential induction of cell cycle arrestin H460 and A549 cancer cells[J]. Molecules,2014,19(11):17663-17681.

[9]Wu Q,Jang M,Piao XL.Determination by UPLC-MS of four dammarane-type saponins from heat-processed Gynostemma pentaphyllum[J].Biosci Biotechnol Biochem,2014,78(2):311-316.

[10]Lin-Na S,Yong-Xiu S.Effects of polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum(Thunb.),Makino on physical fatigue[J].Afr J Tradit Complement Altern Med,2014,11(3): 112-7.

[11]史美榮，李華，白鴿，等.HPLC法測(cè)定絞股藍(lán)中5種皂苷成分的含量[J].食品工業(yè)科技,2015,36(2):49-51,56.

[12]陳英.HPLC法測(cè)定絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1的含量[J].海峽藥學(xué),2013,25(9):84-86.

[13]張轉(zhuǎn)平,王新權(quán),胥道寶,等.HPLC法測(cè)定絞股藍(lán)中絞股藍(lán)皂苷A的含量[J].西北藥學(xué)雜志,2008(2):87-88.

Simultaneous Determination of Various Ingredients Content in Gynostemma Pentaphyllum RP-HPLC-ELSD

LI Hao-fei
Department of Pharmacy，God horse general hospital medical treatment group，Pingdingshan，Henan Province,467000 China

Objective AIM To establish the method for Simultaneous determination of Gypenoside A,Ginsenoside Rb1, Gypenoside XLIX，Gypenoside XVII in Gynostemma pentaphyllum by RP-HPLC-ELSD.Methods An Phenomenex C18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm)was used with the mixture of acetonitrile-0.5%acetic acid as the mobile phase in gradient elution（0～5min,10%A;5～27min,10%～40%A;27.1min,10%A;27.1～30min,10%A）.The flow rate was 1.0mL/min. The column temperature was 30℃.Carrier gas was nitrogen with the volume flow rate for 2.0min/L,atomization temperature was 42℃,drift tube temperature was 65℃,gain was 5.Results The calibration curves of Gypenoside A,Ginsenoside Rb1, Gypenoside XLIX,Gypenoside XVII wre in good linearity over the ranges of 152.4～3048 ng（r=0.9996）,65.2～1304 ng（r=0.9998）, 87.2～11744 ng（r=0.9998）,11.3～226 ng（r=0.9995）,respectively.the average recoveries were 98.65%（RSD of 1.95%），99.33%（RSD of 1.72%），99.67%（RSD of 2.28%），100.06%（RSD of 1.98%）,respectively.content range of 9 group of gynostemma sample were that Gypenoside A for 6.92～22.63 mg/g，Ginsenoside Rb1 for 0～11.23 mg/g，Gypenoside XLIX for 0～13.24 mg/g，Gypenoside XVII for 0～4.16 mg/g.Conclusion The method to determine Saponin compounds in Gynostemma pentaphyllum is sensitive,accurate,separation effect is good,It has no interference,it can provide a basis as evaluation standard for quality of Gynostemma pentaphyllum.

Gynostemma pentaphyllum;HPLC;ELSD

R282.71

A

1672-5654（2015）05（c）-0005-05

2015-03-02）

李浩飛（1977.12-），男，河南魯山人，本科，副主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)。