潘鋼 徐驍誠(chéng) 張煜 彭友 張臥 丁金旺 羅定存

多梳基因Bmi-1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義

潘鋼 徐驍誠(chéng) 張煜 彭友 張臥 丁金旺 羅定存

目的 研究多梳基因Bmi-1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法分別采用免疫組化法、Western blot法和RT-PCR法檢測(cè)30例甲狀腺乳頭狀癌組織、30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織及30例正常甲狀腺組織中多梳基因Bmi-1及其mRNA的表達(dá)情況，并分析Bmi-1與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Bmi-1在甲狀腺乳頭狀癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率73．3%，與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（36．7%）及與正常組織（16．7%）的陽(yáng)性表達(dá)率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。Western blot法檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌中Bmi-1表達(dá)量與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織及正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。RT-PCR法檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌中Bmi-1mRNA表達(dá)量與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織及正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。Bmi-1陽(yáng)性表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），在年齡、性別、腫瘤大小、分期等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論Bmi-1在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)升高，可能在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，并可望作為甲狀腺乳頭狀癌臨床診斷的標(biāo)記物之一。

Bmi-1 甲狀腺乳頭狀癌 RT-PCR Western blot免疫組化法

近年來(lái)，甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)生率呈明顯上升趨勢(shì)，其中5%～15%的甲狀腺結(jié)節(jié)為惡性腫瘤[1]。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤，其好發(fā)于女性和青少年，多起病隱匿，早期診斷困難。臨床上亟需尋找新的方法幫助篩查及早期診斷PTC，以進(jìn)一步提高PTC的診治水平。Bmi-1基因（B cell-specific MLV inte-gration site-1，Bmi-1）為多梳基因（polycomb group genes，PcG）家族成員之一，它首次被提出是1991年在轉(zhuǎn)基因鼠的淋巴瘤細(xì)胞傳代中，作為一種原癌基因與另一種癌基因c-myc協(xié)同作用引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成[2]，目前Bmi-1在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及判斷預(yù)后等方面的作用已越來(lái)越引起大家的重視。筆者采用免疫組化法、Western blot和RTPCR技術(shù)，檢測(cè)PTC組織中Bmi-1及其mRNA表達(dá)水平，以及與PTC臨床病理特征的關(guān)系，進(jìn)而探討其是否能成為PTC早期診斷及判斷預(yù)后的重要分子標(biāo)記物，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2012年8月至2013年2月在我科手術(shù)、并有完整臨床資料的甲狀腺乳頭狀癌組織30例、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織30例及正常甲狀腺組織30例，正常甲狀腺組織來(lái)自單側(cè)甲狀腺乳頭狀癌行甲狀腺雙側(cè)葉切除的健側(cè)組織。所有患者在接受手術(shù)獲取標(biāo)本前未接受過(guò)碘131等治療，病理結(jié)果均由病理科醫(yī)師診斷。甲狀腺正常組織、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織和乳頭狀癌組織在術(shù)中離體后馬上收集放入液氮速凍過(guò)夜，然后移至-80℃冰箱保存直至使用。在30例甲狀腺乳頭狀癌中，男12例，女18例，年齡＜45歲13例，≥45歲17例；根據(jù)（AJCC/UICC）對(duì)分化型甲狀腺癌進(jìn)行臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期18例（60.00%），Ⅲ～Ⅳ期12例（40.00%）；術(shù)后病理結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例（63.33%），未見(jiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例（36.67%）。

1.2 主要試劑 RT-PCR試劑盒購(gòu)于Takara生物制劑公司，總RNA提取試劑Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Bmi-1、GAPDH引物均由上海生工公司合成，Anti-Bmi-1一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Anti-GAPDH一抗購(gòu)自美國(guó)Santa公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bmi-1表達(dá) 常規(guī)石蠟包埋組織，切片脫蠟，水化，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原修復(fù)后，滴加兔抗人Bmi-1單克隆抗體（1∶200）及二抗（酶標(biāo)記抗兔IgG）后37℃孵育2h。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片，同時(shí)以PBS替代一抗（兔抗人Bmi-1單克隆抗體）作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色。隨機(jī)取5個(gè)不同的200倍視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)以及細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。按陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞率≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；根據(jù)染色的強(qiáng)弱程度計(jì)分：陰性染色1分，弱染色2分，中等強(qiáng)度染色3分，強(qiáng)染色4分。根據(jù)兩者的乘積判斷結(jié)果：≤4分為陰性；＞4分且≤8分為弱陽(yáng)性；＞8分且≤12分為陽(yáng)性；＞12分且≤16分為強(qiáng)陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)陰性和弱陽(yáng)性合計(jì)為低表達(dá)，陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性合計(jì)為高表達(dá)。以上結(jié)果均至少由2位病理科醫(yī)師以盲法觀察確定。

1.4 Western blot法檢測(cè)Bmi-1表達(dá) 分別提取甲狀腺乳頭狀癌組織、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織、正常甲狀腺組織的總蛋白，應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度。上樣量均為50μg/孔，行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，兔抗人Bmi-1單

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，不同組織中Bmi-1 mRNA表達(dá)水平RTPCR及免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，Western blot檢測(cè)結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢測(cè)后采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。不同臨床病理因素與Bmi-1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)不同甲狀腺組織中Bmi-1的表達(dá)情況 免疫組化檢測(cè)正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織、甲狀腺乳頭狀癌組織中Bmi-1在細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒，也有少量為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色（圖1）。甲狀腺乳頭狀癌組織中Bmi-1陽(yáng)性表達(dá)率73.3%（22例），與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織陽(yáng)性表達(dá)率36.7%（11例）及與正常甲狀腺組織陽(yáng)性表達(dá)率16.7%（5例）的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組及正常組中Bmi-1陽(yáng)性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 Western blot檢測(cè)不同甲狀腺組織中Bmi-1的表達(dá)情況 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示甲狀腺正常組織、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織、甲狀腺乳頭狀癌組織中Bmi-1的相對(duì)表達(dá)量分別為0.26±0.23、0.98±0.33、1.43±0.46，克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的二抗（辣根標(biāo)記抗兔IgG）室溫孵育2h后使用ECL試劑發(fā)光，顯影、定影，膠片掃描后應(yīng)用Westem blot圖像分析軟件，以測(cè)定的Bmi-1蛋白條帶的積分光密度與內(nèi)參蛋白條帶的光密度的比值表示組織內(nèi)目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)復(fù)孔，取平均值以減小誤差。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)Bmi-1表達(dá) 按照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取組織總RNA，測(cè)定RNA濃度后各取5μgRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件：[95℃×5s+60℃×30s]× 40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為20μl，獲得相應(yīng)的cDNA。然后進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)體系：2×SYBR Premix TaqTM10μl，Rox reference Dye I 0.4μl，F(xiàn)orward primer 0.4μl，Reverse primer 0.4μl，dH2O 6.8μl，cDNA 2μl。Bmi-1引物序列為5′-ATTAGTTCCAGGGCTTTTCA-3′和5′-TCATTCACCTCCTCCTTAGATT-3′；GAPDH為內(nèi)參，引物序列為5′-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3′和5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3′。反應(yīng)條件：[95℃×5s+60℃× 30s]×40個(gè)循環(huán)。對(duì)所用標(biāo)本進(jìn)行上述RT-PCR反應(yīng)，GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔCT計(jì)算Bmi-1相對(duì)表達(dá)量。與甲狀腺正常組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組相比，甲狀腺乳頭狀癌組織中Bmi-1表達(dá)水平明顯升高，且甲狀腺結(jié)節(jié)組織中的Bmi-1水平也明顯高于正常組織中的水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2）。

圖1 不同甲狀腺組織中Bmi-1的表達(dá)情況（N:正常甲狀腺組織；NG：結(jié)節(jié)性甲狀腺腫；C：甲狀腺乳頭狀癌；SP染色，×200）

圖2 不同甲狀腺組織中Bmi-1表達(dá)情況（N：正常甲狀腺；NG：結(jié)節(jié)性甲狀腺腫；C：甲狀腺乳頭狀癌）

2.3 RT-PCR法檢測(cè)不同甲狀腺組織中Bmi-1mRNA的表達(dá)情況 RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌組、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組中的表達(dá)量分別為5.836±0.498、3.236±0.301和1.521±0.211，甲狀腺乳頭狀癌組高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），詳見(jiàn)圖3。

圖3 不同甲狀腺組織中Bmi-1 mRNA的表達(dá)情況（N：正常甲狀腺；NG：結(jié)節(jié)性甲狀腺腫；C：甲狀腺乳頭狀癌）

2.4 Bmi-1表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 在I～I(xiàn)I期和Ⅲ～Ⅳ期中Bmi-1陽(yáng)性率分別為55.6%（10/18）和66.7%（8/12），Bmi-1的表達(dá)與腫瘤臨床分期的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在男性和女性患者中Bmi-1陽(yáng)性率分別為41.7%（5/12）和44.4%（8/18），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在＜45歲和≥45歲患者中Bmi-1陽(yáng)性率分別為46.2%（6/13）和58.8%（10/17），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明Bmi-1的表達(dá)與男女性別及年齡均無(wú)關(guān)。在22例Bmi-1陽(yáng)性表達(dá)的甲狀腺乳頭狀癌患者中，術(shù)后病理證明有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有81.8%（18/22），而術(shù)后病理未發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有18.2%（4/22），經(jīng)Fisher確切概率法統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，Bmi-1的陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

近年來(lái)，全球甲狀腺癌的發(fā)病率增長(zhǎng)迅速，引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。美國(guó)最新資料顯示，1989-2012年甲狀腺癌的發(fā)病率上升了5倍，其中男性以每年5.5%、女性以每年6.6%的速度持續(xù)增長(zhǎng)，現(xiàn)已成為美國(guó)增長(zhǎng)速度最快的惡性腫瘤[3]。我國(guó)2012年衛(wèi)生部報(bào)告也指出“甲狀腺癌已成為中國(guó)女性第3位的常見(jiàn)惡性腫瘤，尤其在沿海地區(qū)更為高發(fā)”。2013年浙江省杭州市疾控中心公布的最新“癌譜”指出，甲狀腺癌已位居該市居民惡性腫瘤第2位，對(duì)女性而言則是首次超過(guò)乳腺癌躍居發(fā)病首位的惡性腫瘤。由此可見(jiàn)，甲狀腺癌不僅威脅著人們的健康，而且極大增加了政府、社會(huì)和家庭的負(fù)擔(dān)，因此如何獲取積極有效的甲狀腺癌早期診斷及判斷預(yù)后的標(biāo)志物是目前研究的熱點(diǎn)。

Bmi-1是多梳基因PcG家族成員之一，在多種人類多種惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌及泌尿系腫瘤中的表達(dá)普遍上調(diào)[4-11]。Bmi-1可以通過(guò)調(diào)控INK4a-ARF、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）和HOX基因家族等下游基因，啟動(dòng)DNA復(fù)制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；并且在染色體末端合成端粒重復(fù)片段，以補(bǔ)償細(xì)胞分裂時(shí)的端?？s短，維持端粒長(zhǎng)度，使細(xì)胞獲得無(wú)限增殖能力而逃避衰亡，從而在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。目前Bmi-1在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及判斷預(yù)后等方面的作用已越來(lái)越引起大家的重視[12-13]。有研究顯示，Bmi-1在甲狀腺髓樣癌中也有高表達(dá)，對(duì)診斷甲狀腺髓樣癌有指導(dǎo)意義[14]。而PTC是最常見(jiàn)的甲狀腺癌組織學(xué)亞型，近20年甲狀腺癌發(fā)病率不斷飆升[15]，因此針對(duì)PTC的相關(guān)研究日益成為腫瘤學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1在PTC組織中存在高表達(dá)，而在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和正常甲狀腺組織中低表達(dá)或基本不表達(dá)（P＜0.05）。Bmi-1高表達(dá)率與PTC患者年齡、腫瘤分期、性別無(wú)關(guān)（P＞0.05），而與有無(wú)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，即Bmi-1在伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者中的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于頸淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者（P＜0.05），提示Bmi-1可能在PTC的轉(zhuǎn)移機(jī)制中起重要作用。已知腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制之一是腫瘤細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)，其中整合素是比較重要的細(xì)胞外基質(zhì)之一。甲狀腺癌可隨著Bmi-1的表達(dá)逐漸釋放整合素受體，再通過(guò)與整合素結(jié)合增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)與癌細(xì)胞的粘連，使腫瘤突破細(xì)胞基底膜，成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這與整合素受體的生成有密切關(guān)系[16]，Bmi-1也可以通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞中端粒酶的活性促進(jìn)其擴(kuò)增，與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。此外，Bmi-1作為c-myc癌基因的協(xié)同基因，在細(xì)胞的中心體擴(kuò)增調(diào)節(jié)中起著重要作用，異常的中心體可以導(dǎo)致染色體的異常分裂，干擾細(xì)胞正常活動(dòng)而發(fā)生癌變。由此可見(jiàn)，Bmi-1高表達(dá)與PTC的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。雖然PTC的生物學(xué)行為相對(duì)惰性，預(yù)后較好，但據(jù)統(tǒng)計(jì)仍有30%～80%的PTC患者在確診時(shí)就伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，即便是甲狀腺微小乳頭狀癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率也可高達(dá)47.6%[18-19]，且頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是判斷PTC預(yù)后的重要因素，有一些研究已經(jīng)證實(shí)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移會(huì)增加PTC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的概率，并且可能會(huì)增加病死率[20-23]。Nam等[24]和Takada等[25]研究認(rèn)為，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤復(fù)發(fā)的顯著影響因素，完整切除原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)是降低局部復(fù)發(fā)率和避免再次手術(shù)的關(guān)鍵。因此，如何進(jìn)行淋巴結(jié)清掃對(duì)降低PTC局部復(fù)發(fā)率和病死率均具有重要意義。本研究證實(shí)Bmi-1在PTC中高表達(dá)，且與PTC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，故其可能成為PTC早期診斷及判斷預(yù)后的候選分子標(biāo)志物。由于Bmi-1的檢測(cè)有助于判斷PTC患者的預(yù)后，使臨床上在術(shù)前判斷甲狀腺癌的生物學(xué)行為成為可能，對(duì)于Bmi-1高表達(dá)的患者，由于其易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在結(jié)合影像學(xué)檢查的基礎(chǔ)上，可選擇更積極的頸淋巴結(jié)清掃手術(shù)治療，手術(shù)后更需注意其高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

惡性腫瘤的發(fā)展是一個(gè)多階段、多步驟、多因素參與的過(guò)程，隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，甲狀腺癌的診斷方法雖較多，但早期診斷及侵襲轉(zhuǎn)移性的判斷在臨床尤為重要，以便客觀判斷患者的預(yù)后。本研究提示Bmi-1可能在PTC轉(zhuǎn)移中起重要作用，在鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良、惡性以及判斷PTC侵襲性特征，尤其是頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中也體現(xiàn)出較好的價(jià)值，并有可能使之成為一個(gè)新的早期診斷和判斷PTC預(yù)后的重要分子標(biāo)記物，并為進(jìn)一步探討其可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子傳導(dǎo)途徑及提供新的基因治療靶點(diǎn)打下基礎(chǔ)。

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ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of Bmi-1 in papillary thyroid carcinoma．MethodsThe expression of Bmi-1 mRNA and protein was detected by RT-PCR,Western blot and immunohistochemistry in 30 samples of papillary thyroid carcinomas,30 samples of nodular goiters and 30 samples of normal thyroid tissue,respectively．The correlation of Bmi-1 expression with clinicopathological features of patients was also analyzed．ResultsThe results of immunohistochemistry showed that the positive rates of Bmi-1 protein in papillary thyroid carcinomas，nodular goiters，normal thyroid tissues were 73．3%,36．7%and 16．7%,respectively(P＜0．05)．Western blot showed that the expression of Bmi-1 protein in papillary thyroid carcinomas was significantly higher than those in nodular goiter tissue and normal tissue(P＜0．05)．The expression of Bmi-1mRNA in papillary thyroid carcinomas was significantly higher than those in nodular goiters and normal thyroid tissues (P＜0．05)．Bmi-1 expression was closely relevant to lymph node metastasis(P＜0．05),but not to gender,age and differentiation degree．ConclusionThe expression of Bmi-1 gene is up-regulated in papillary thyroid carcinomas,indicating that Bmi-1 may be involved in the development of papillary thyroid carcinoma and may serve as a marker for clinical diagnosis．

Bmi-1 Papillary thyroid carcinoma RT-PCR Western blotImmunohistochemistry

2014-11-12）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

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