蘇君梅 葛衛(wèi)紅 許廣艷 張宇

2型糖尿病患者尿液的代謝組學(xué)研究

蘇君梅 葛衛(wèi)紅 許廣艷 張宇

目的 從代謝組學(xué)角度分析并尋找2型糖尿?。═2DM）患者可能的代謝標(biāo)記物。方法選取30例初診、或有糖尿病史經(jīng)藥物治療控制不理想且無并發(fā)癥的T2DM患者，另選取30例性別、年齡匹配的健康者為正常對(duì)照。收集清晨空腹中段尿，以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對(duì)尿液樣本進(jìn)行代謝圖譜分析，正交偏最小二乘法判別研究尿液內(nèi)源性化合物在兩組間的差異。結(jié)果T2DM組和正常對(duì)照組尿液代謝譜明顯分離。與正常對(duì)照組比較，T2DM組尿液2,3,4-三羥基丁酸、肌醇、D-葡萄糖、D-葡萄糖酸及尿素含量升高（P＜0．05或0．01），馬尿酸含量減少（P＜0．01）。結(jié)論代謝組學(xué)檢查提示T2DM患者尿液中代謝標(biāo)志物為2，3，4-三羥基丁酸、肌醇、馬尿酸、D-葡萄糖、D-葡萄糖酸及尿素，觀察這些標(biāo)志物含量的變化有助于T2DM的臨床診斷及發(fā)病機(jī)制研究。

代謝組學(xué) 2型糖尿病 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 正交偏最小二乘法判別

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種以胰島素抵抗伴胰島素分泌缺陷或胰島素敏感性降低而引起的、以糖代謝失常為主的內(nèi)分泌代謝性疾病，表現(xiàn)為整體的代謝紊亂。作為一種代謝綜合征，T2DM很難用單一的評(píng)價(jià)指標(biāo)和發(fā)病機(jī)制來反映其發(fā)生及變化，而代謝組學(xué)作為一種全面研究生物機(jī)體或組織細(xì)胞動(dòng)態(tài)代謝的技術(shù)手段，在疾病的診斷、標(biāo)志物篩查、發(fā)病機(jī)制以及藥物研發(fā)等方面的應(yīng)用正成為研究的前沿領(lǐng)域[1-2]。近年研究報(bào)道，利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)糖尿病患者組織或體液中代謝物種類及含量的變化進(jìn)行分析，尋找主要的差異代謝物，對(duì)監(jiān)測(cè)糖尿病的發(fā)生、發(fā)展和輔助其臨床早期診斷、探索發(fā)病機(jī)制具有重要意義[3-4]。筆者采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)T2DM患者尿液中內(nèi)源性小分子代謝物進(jìn)行分析，探索T2DM的代謝組學(xué)特征，尋找與其密切相關(guān)的潛在代謝標(biāo)記物，通過分析相關(guān)代謝物信息，為T2DM臨床檢測(cè)和診斷提供新的思路，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2011年6月至2013年5月浙江省中醫(yī)院內(nèi)分泌科確診的T2DM患者30例，均為初診T2DM或有糖尿病史經(jīng)藥物治療控制不理想者，均符合1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，并排除應(yīng)激及冠心病、溶血性疾病、肝腎功能異常及感染者。其中男15例，女15例，年齡36～73歲，平均（54.7±10.3）歲。另選取浙江省中醫(yī)院與T2DM患者性別、年齡匹配的30例健康體檢者作為正常對(duì)照組，均無肥胖、高血壓、糖脂代謝紊亂等病史，男15例，女15例，年齡33～78歲，平均（52.1±14.1）歲。根據(jù)知情同意原則采集尿液，所有受試者禁食12h，留取清晨空腹中段尿，樣品密封，儲(chǔ)存于-80℃的超低溫冰箱中，待測(cè)。

1.2 試劑和儀器 MSTFA含1%TMCS、鹽酸甲氧胺、十七烷酸、脲酶購自美國Sigma公司；吡啶等試劑（分析純）購自成都科龍化工試劑廠；正庚烷（色譜純）購自美國Fluka公司；日本島津GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent色譜工作站。色譜柱：Agilent ZB-5MS（0.25mm×30mm，0.25μm）。數(shù)據(jù)處理軟件：美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院NISTl05標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，瑞典U-metrics公司Simca-P12.0軟件。

1.3 方法

1.3.1 樣本前處理 將凍存的尿樣在室溫下解凍。取200μl尿樣置于離心管中，加入20μl脲酶混勻，于37℃水浴。再加入20μl十七烷酸及400μl丙酮，渦旋混勻冰浴，以10 000r/min、4℃低溫高速離心。取上清液400μl于進(jìn)樣瓶中，氮?dú)獯蹈?，加?0μl甲氧胺吡啶溶液置于70℃烘箱中反應(yīng)1h后加入75μl衍生化試劑 [V（MSTFA）∶V（TMCS）=100∶1]，于室溫下繼續(xù)反應(yīng)1h，加入150μl的正庚烷以終止衍生化反應(yīng)，待進(jìn)樣。

1.3.2 GC-MS分析 色譜條件：色譜柱DB-5MS，毛細(xì)管柱（0.25mm×30mm，0.25μm），進(jìn)樣口溫度270℃，離子源溫度230℃。程序升溫起始溫度85℃，保持5min；以8℃/min升至125℃，保持7min；以10℃/min升至190℃，保持10min；再以10℃/min升至300℃，保持5min。氦氣作為載氣，流速設(shè)為1ml/min，不分流，進(jìn)樣量為1μl。質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70eV，掃描范圍60～600m/z，全掃描方式。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 原始GC/MS數(shù)據(jù)文件通過運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)室自定義MATLAB（Matlab7.1，The MathWorks,Inc. Popularity）腳本進(jìn)行基線矯正、峰判別和匹配、內(nèi)標(biāo)和系統(tǒng)雜峰的排除和峰的歸一化等計(jì)算過程，最終得到由指定的峰序列號(hào)（保留時(shí)間/質(zhì)荷比）、觀測(cè)點(diǎn)（樣品號(hào)）以及歸一化后的峰面積組成的三維矩陣數(shù)據(jù)集，導(dǎo)入Simca-P12.0軟件進(jìn)行OPLS-DA分析，運(yùn)用變量投影重要性分析（variable importance for the projection，VIP）方法區(qū)分兩組間代謝輪廓貢獻(xiàn)較大的代謝物。多維統(tǒng)計(jì)中找到的差異代謝物應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和單因素ANOVA分析的驗(yàn)證，結(jié)合VIP值＞1并差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的代謝物確定為潛在標(biāo)記物。

2 結(jié)果

2.1 樣品總離子流圖 使用GC-MS為基礎(chǔ)的代謝指紋譜分析方法對(duì)T2DM組和正常對(duì)照組樣本進(jìn)行分析，得到各組代表性樣本總離子流圖（total ion chromatogram，TIC），見圖1。從總離子流圖可直觀識(shí)別出兩組之間在同一保留時(shí)間色譜峰大小、高低表達(dá)有差異。

圖1 總離子流圖（N：正常對(duì)照組；D：T2MD組）

2.2 樣本的OPLS-DA分析 OPLS-DA分析可以除去非實(shí)驗(yàn)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，提高判別的靈敏度，是在代謝組學(xué)研究中比較理想的數(shù)據(jù)分析手段。因此為深層次研究T2DM代謝輪廓的改變，尋找與T2DM相關(guān)的差異代謝產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)建立OPLS-DA得分圖，見圖2。在建模之前，預(yù)先設(shè)定一個(gè)Y值，用來提取代謝物矩陣（X矩陣）中與Y值最相關(guān)的數(shù)據(jù)信息，將正常對(duì)照組樣本的Y值設(shè)定為0，T2DM組樣本的Y值設(shè)定為1。圖中顯示，兩組的尿液代謝譜明顯分離，表明該方法得到了很好的區(qū)分模型，且這種監(jiān)督的方法建立的模型，可以找到對(duì)模型影響較大的代謝物變量。此外，利用OPLS-DA建模，得到R2X1與R2X2的累計(jì)量為0.638，而Q2Ycum達(dá)到了0.851，說明模型的區(qū)分程度和預(yù)測(cè)程度較好。為了進(jìn)一步分析引起組間類別差異的特征峰，確定濃度在T2DM組和正常對(duì)照組樣本中變化很大的潛在標(biāo)志物，本研究給出T2DM組與正常對(duì)照組尿液的OPLS-DA載荷圖，見圖3。圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)代謝物，若該點(diǎn)偏離中心越遠(yuǎn)表明該變量對(duì)模型的貢獻(xiàn)越大。結(jié)合分析模型的VIP數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)20種含量變化明顯的內(nèi)源性化合物。

圖2 正常對(duì)照組與T2DM組尿液樣本OPLS-DA得分圖

圖3 正常對(duì)照組與T2DM組尿液樣本OPLS-DA載荷圖

2.3 潛在標(biāo)記物 為尋找與T2DM高度相關(guān)的代謝物，采用OPLS-DA法對(duì)正常對(duì)照組和T2DM組尿液樣本共有的20種代謝物重新建模，尋找VIP＞1的高度相關(guān)代謝物。將得到的VIP＞1的代謝物通過NIST05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，進(jìn)行質(zhì)譜信息匹配，對(duì)可能的潛在標(biāo)記物進(jìn)行初步鑒定，共發(fā)現(xiàn)6種含量變化明顯的內(nèi)源性化合物，且6種物質(zhì)兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），確定為潛在的生物標(biāo)記物，詳見表1。

表1 尿液代謝譜中6種主要代謝物的變化

3 討論

代謝組學(xué)通過分析生物體中內(nèi)源性物質(zhì)代謝的動(dòng)態(tài)變化，描繪出生物體代謝輪廓，探索內(nèi)源性物質(zhì)代謝與疾病的關(guān)系。T2DM是整體代謝紊亂的內(nèi)分泌代謝性疾病，因此，應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)從生物體液中代謝物的角度研究T2DM患者尿液中代謝物的變化，探尋與疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物，對(duì)于輔助臨床早期診斷、疾病的治療、監(jiān)測(cè)等具有重要意義。

Zhao等[6]采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-qTOF-MS）的非靶向代謝組學(xué)方法研究糖耐量降低者和正常者血樣和尿樣代謝指紋圖譜，結(jié)果顯示對(duì)照組和病理組能完全區(qū)分開，血漿脂肪酸、色氨酸及尿酸等代謝異常，尿液中與腸道菌群相關(guān)的代謝物變化明顯，認(rèn)為是T2DM的特征性變化，對(duì)糖尿病早期診斷和預(yù)防意義重大。Han等[7]應(yīng)用GC-MS技術(shù)檢測(cè)糖尿病患者血漿代謝物輪廓，發(fā)現(xiàn)血漿中脂肪酸水平的變化與糖尿病及糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，認(rèn)為這些代謝物的變化可用于監(jiān)測(cè)糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。因此，本研究利用GC/MS-OPLS-DA分析方法對(duì)T2DM組和正常對(duì)照組尿液代謝圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理和建模，結(jié)果顯示，T2DM組與正常對(duì)照組完全分離，表明兩組間尿液代謝輪廓圖譜存在著明顯差異；采用NIST05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比鑒定，尿液中6種內(nèi)源性化合物含量變化兩組間差異明顯。由此認(rèn)為，利用代謝組學(xué)技術(shù)可尋找、檢測(cè)T2DM潛在代謝標(biāo)志物；提示從代謝水平分析T2DM尿液代謝圖譜、篩選疾病相關(guān)標(biāo)志性代謝物將有助于T2DM的臨床診斷和治療，同時(shí)這些代謝物的變化與T2DM的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，利于從小分子代謝物角度對(duì)T2DM的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行深入理解。

本研究結(jié)果顯示，T2DM患者尿液中多種代謝物含量發(fā)生了變化。從潛在生物標(biāo)記物的鑒定結(jié)果來看，生物標(biāo)記物的變化與糖、能量及氨基酸等代謝有關(guān)。本研究中，兩組間2，3，4-三羥基丁酸、肌醇、馬尿酸、D-葡萄糖、D-葡萄糖酸及尿素含量差異顯著。在T2DM組，β-羥丁酸的前體2，3，4-三羥基丁酸含量明顯高于正常對(duì)照組。而β-羥丁酸作為酮體的主要組分（78%），是臨床診斷潛在致命性糖尿病酮癥酸中毒的可靠指標(biāo)。T2DM患者中酮癥酸中毒較常見，提示2,3,4-三羥基丁酸是T2DM潛在代謝標(biāo)記物之一，尤其對(duì)糖尿病酮癥酸中毒的及時(shí)診斷、早期治療具有重要意義[8]。

肌醇作為合成磷脂酰肌醇的底物，由葡萄糖合成，有類似維生素樣物質(zhì)的作用。糖尿病患者尿液中肌醇含量顯著增加，認(rèn)為糖尿病時(shí)代謝紊亂而致肌醇流失，最終造成胰島素作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻[9]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者神經(jīng)組織中肌醇缺乏，影響了神經(jīng)能量代謝，致神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，認(rèn)為肌醇代謝障礙與糖尿病神經(jīng)病變有關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示，T2DM組尿液肌醇含量明顯增高，這可能與糖尿病時(shí)多元醇通路受損以及細(xì)胞滲透壓增高使肌醇的攝入量代償性減少有關(guān)，提示肌醇可能為T2DM及其并發(fā)癥的潛在代謝標(biāo)記物[11]。

馬尿酸是尿液中的一種正常成分，是腸道菌群代謝產(chǎn)生的含苯環(huán)的化合物，由苯甲酸與甘氨酸在肝藥酶細(xì)胞色素p450催化合而產(chǎn)生，馬尿酸的變化與腸道菌群的改變有關(guān)，也與肝功能變化相關(guān)聯(lián)[6，12]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠尿液中馬尿酸較正常大鼠的表達(dá)水平有顯著差異；在糖尿病大鼠，尿液中馬尿酸水平明顯降低，認(rèn)為糖尿病大鼠腸道內(nèi)菌群代謝發(fā)生紊亂[13-14]。本研究中T2DM組尿液中馬尿酸含量也明顯減少，提示T2DM時(shí)腸道微生物環(huán)境可能遭到破壞，肝藥酶細(xì)胞色素p450活性下降，影響了馬尿酸的代謝[6]。也有學(xué)者認(rèn)為，尿液中馬尿酸的改變可作為腎臟毒性損傷的生物學(xué)標(biāo)記[15]。新近研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群是控制體重與能量平衡的一個(gè)重要環(huán)境因素，腸道菌群可能與肥胖、T2DM等代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系[16-18]，這對(duì)糖尿病的病理生理機(jī)制提出了新的研究思路。

正常情況下，葡萄糖主要通過糖酵解和TCA循環(huán)分解供能，T2DM患者由于存在胰島素抵抗，葡萄糖分解減少而糖原分解和糖異生增強(qiáng)。本研究中T2DM患者尿液中葡萄糖水平顯著增加，表明T2DM患者存在糖代謝通路紊亂，而尿液中出現(xiàn)葡萄糖依然是糖尿病診斷的重要標(biāo)志物。D-葡萄糖酸是葡萄糖氧化產(chǎn)物，與葡萄糖對(duì)應(yīng)，可視為T2DM的潛在代謝標(biāo)記物。尿素是在尿素循環(huán)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)代謝的主要最終產(chǎn)物。本研究中T2DM患者尿液尿素水平的升高，提示患者體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸分解產(chǎn)生的含氮代謝物的代謝過程發(fā)生紊亂[8，19]。此外，T2DM患者尿液中D-葡萄糖酸、尿素濃度的升高，提示隨病情進(jìn)展腎功能有損傷[20]，這也為深入研究糖尿病腎臟病變提供了代謝組學(xué)依據(jù)。

代謝組學(xué)技術(shù)能夠更全面的反映生物體的代謝變化，幫助人們更好地了解生物體中各種復(fù)雜的代謝通路。本研究基于GC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)分析T2DM患者尿液內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的變化，顯示T2DM發(fā)生、發(fā)展過程中的代謝特征，為T2DM臨床檢測(cè)和診斷提供了新的思路，同時(shí)在分子水平為T2DM及其并發(fā)癥病理機(jī)制的探討提供理論依據(jù)。

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ObjectiveTo investigate the urinary metabonomics in patients with type 2 diabetes mellitus．MethodsThirty patients with type 2 diabetes mellitus were enrolled as study group,and 30 health subjects served as controls．The morning midstream urine samples were collected．Gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)was used to analyze metabonomics of the urine samples．Orthogonal partial least-squares discriminant analysis(OPLS-DA)was applied to identify potential biomarkers．ResultsThe difference of metabonomics spectra was observed between diabetic patients and normal controls．Compared with the normal controls,the contents of 3-hydroxybutyrate,inositol,D-glucose,D-gluconic acid,urea were increased(P＜0．05 or P＜0．01）and hippuric acid decreased significantly(P＜0．01)in type 2 diabetic patients．ConclusionThe 3-hydroxybutyrate,inositol,hippuric acid,D-glucose,D-gluconic acid and urea in the urine might be the candidate biomarkers for type 2 diabetes mellitus．

Metabonomics Type 2 diabetes mellitus Gas chromatography-mass spectrometry Orthogonal partial least-squares discriminant analysis

2014-04-18）
（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省錢江人才計(jì)劃（2010D003）

310053 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（蘇君梅、葛衛(wèi)紅、許廣艷）；浙江省中醫(yī)院內(nèi)科（張宇）

葛衛(wèi)紅，E-maill:geweihong@hotmail.com