朱明　孟學平　趙軍　楊官品

摘要：基于線粒體DNA的細胞色素C氧化酶亞基1基因（cox1），分析貽貝科8個屬中13個物種的種間、種內遺傳差異及系統(tǒng)發(fā)育關系，結果表明，屬間遺傳距離為0.245～0.630，平均為0.487；同物種的母系和父系cox1遺傳距離為0.21～0.24；新西蘭綠唇貽貝與資料中的綠唇貽貝和Perna perna聚為1支，支持率為100%，后與翡翠貽貝聚為1支；13個物種中，除Trichomya hirsuta與貽貝屬種類聚為1支外，其余各屬均聚為單系支，貽貽屬Mytilus、股貽貝屬Perna、肌蛤屬Musculista 3個屬遺傳關系近。

關鍵詞：貽貝科；cox1基因；綠唇貽貝；遺傳差異；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號： S917 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0023-05

貽貝科屬于軟體動物門瓣鰓綱貽貝目（Mytiloida），現(xiàn)有33個屬約250個種[1]。新西蘭綠唇貽貝Perna canaliculus（Gmelin，1791）、翡翠貽貝Perna viridis（Linnaeus，1785）隸屬于貽貝科股貽貝屬（Perna），紫貽貝Mytilus galloprovincialis （Lamarck，1819）屬于貽貝屬（Mytilus），翡翠貽貝和紫貽貝是我國主要養(yǎng)殖的2種貝類[2]。翡翠貽貝自然分布于西太平洋及印度洋熱帶和亞熱帶海域，我國主要分布在東海南部及南海；紫貽貝在世界上分布范圍非常廣，在我國被認為是1個外來種，目前南北沿海均有分布[3]；新西蘭綠唇貽貝是股貽貝屬中新西蘭特有的1個物種，是新西蘭的重要海產種質[4-5]，其脂溶性提取物有顯著的抗炎作用，對慢性關節(jié)炎具有很好的療效，在生活中得到廣泛應用[6]，新西蘭年養(yǎng)殖產值為1.90億美元[7]。有關貽貝科物種群體遺傳差異研究有許多報道[8-11]，如位正鵬等基于cox1基因研究了股貽貝屬3種貽貝的系統(tǒng)關系[12]，劉君等研究了cox1基因在貽貝科鑒定中的應用[13]，葉瑩瑩等基于16S rRNA基因研究了厚殼貽貝4個群體的遺傳結構[14]。有關綠唇貽貝幼蟲附著變態(tài)的研究也有較多報道[7，15-16]，但綠唇貽貝的分子系統(tǒng)學研究未見報道。本試驗通過擴增新西蘭綠唇貽貝、翡翠貽貝和紫貽貝的cox1片段，研究其序列結構特點、序列差異水平，并結合GenBank檢索到的貽貝科cox1序列，分析其系統(tǒng)演化關系，為生物入侵監(jiān)測及貽貝科國際種質資源交流管理提供理論依據和技術手段，也為貽貝科類群的系統(tǒng)演化關系提供資料，對我國貽貝的養(yǎng)殖及綠唇貽貝的引種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本

綠唇貽貝6個個體，采于新西蘭奧克蘭；翡翠貽貝18個個體，采于福建廈門；紫貽貝15個個體，采于江蘇連云港。取閉殼肌備用。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

采用CTAB法裂解組織，酚-氯仿抽提、乙醇沉定法獲得總DNA。綠唇貽貝和翡翠貽貝cox1片段長為750 bp，擴增所用引物為ACOIF：5′-CGDATTCARCTWTCTCAYCCHGG-3′和ACOIR：5′-AMMGTAAAYATRTGRTGMGCCC-3′；紫貽貝cox1片段為889 bp，擴增所用引物為Med-cox1-F：5′-TGGGGTCTGAGGAGGTTTGT-3′和Med-cox1-R：5′-CCCTGTAGGGACTGCGATTA-3′。PCR擴增程序：94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸 1 min。反應體系為25 μL，Taq酶1～2 U。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，將有效擴增PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司用ABI-PRISM 3730測序儀雙向測序。

1.3 序列比對分析

測序獲得的原始DNA序列用DNAStar軟件包中的SeaMan軟件組裝，結合測序峰圖進行人工校對，獲得可靠的DNA序列；用ClustalX軟件對DNA序列進行排序，將5′、3′端取齊，轉換成 .meg文件；用DnaSP 5.0軟件檢測單倍型，用Mega 4軟件分析序列特征，計算遺傳距離，構建NJ （K2-P法）系統(tǒng)進化樹，進行遺傳差異分析；GenBank中檢索貽貝科cox1序列資料，與本試驗序列資料一起分析貽貝科屬間、種間遺傳差異及系統(tǒng)發(fā)育關系。

2 結果與分析

2.1 3種貽貝的cox1序列差異分析

由表1可見，經測序拼接和人工校對，從新西蘭綠唇貽貝、翡翠貽貝和紫貽貝3種貝類cox1片段中共獲得39條序列，其中綠唇貽貝6條，翡翠貽貝18條，紫貽貝15條，校對后cox1的PCR產物可信長度紫貽貝為850 bp、綠唇貽貝和翡翠貽為730 bp左右；5′、3′端取齊進行核苷酸差異分析，共檢測到20種單倍型，其中綠唇貽貝6個個體有5種單倍型，翡翠貽貝18個個體有6種單倍型，紫貽貝15個個體有9種單倍型，3種貝類種間無共享單倍型。綠唇貽貝、翡翠貽貝和紫貽貝cox1單倍型G+C含量明顯低于A+T含量，平均分別為0.362、0.340、0.373。由圖1可見，3種貽貝20種單倍型進行序列比對，共有665個比對位點，其中變異位點由248個，占37.3% （圖1中僅列出180個變異位點）；綠唇貽貝與翡翠貽貝cox1變異位點有195個，占變異位點的29.3%，紫貽貝與綠唇貽貝和翡翠貽貝之間核苷酸變異位點分別為212和197個，分別占變異位點的31.9%、29.6%；綠唇貽貝、翡翠貽貝、紫貽貝3種貽貝種內個體間的核苷酸變異位點分別占變異位點的1.7%、1.5%、3.3%，與紫貽貝相比，綠唇貽貝與翡翠貽貝間核苷酸差異較小，共享變異位點相對較多，但cox1片段不同部位共享變異位點多少有不同。圖1中下方左側方框10個堿基中有7個共享變異位點，右側方框中只有2個共享變異位點，有8個非共享變異位點分布在連續(xù)的25個堿基序列中，此區(qū)域可用于設計區(qū)分2種貽貝的PCR特異引物。

2.2 3種貽貝的遺傳距離

基于cox1核苷酸序列的遺傳距離顯示，綠唇貽貝（LYB）、翡翠貽貝（FCYB）和紫貽貝（ZYB）的種內遺傳距離分別為0.007、0.005和0.014，種間遺傳距離為0.242（LYB-FCYB）、0.355（ZYB-FCYB）、0.393（ZYB-LYB）；綠唇貽貝與翡翠貽貝同屬股貽貝屬，其差異屬于屬內種間差異，因此兩兩遺傳距離相對小，而綠唇貽貝、翡翠貽貝與紫貽貝遺傳距離相對較大。

2.3 貽貝科貝類cox1核苷酸差異分析

從GenBank檢索到貽貝科13個物種403條cox1片段序列（表2）用于分析種內遺傳距離，結果表明，加里弗尼亞貽貝（Mytilus californianus） 440 bp的cox1片段核苷酸序列92個個體為M型、87個個體為F型，種內個體間遺傳距離平均分別為0.004、0.010，M型與F型間的遺傳距離為0.244；Geukensia demissa 57個序列間遺傳距離0.000～0.026，平均為0.013；Limnoperna pulex 38個序列間遺傳距離為0.000～0.053，平均為0.026；Mytilus edulis 26個序列間遺傳距離，M型為0.009，F(xiàn)型為0.012，M型和F型之間的遺傳距離為0.244；翡翠貽貝cox1（409 bp）片段20個序列的遺傳距離為0.000～0.012，平均為0.005；基于33個 cox1片段（454 bp）的紫貽貝，其平均遺傳距離為0.035，根據序列特征可將其序列分為3組即Mga1、Mga2和Mga3，其組內遺傳距離分別為0.007、0.008、0.035，Mga1和Mga2間的遺傳距離為0.019，Mga3和Mga1、Mga2間的遺傳距離分別是0.062、0.063，Mga3存在明顯的遺傳分化，Mga1和Mga2間無分化；基于cox1片段（500 bp）Perna perna 20個序列的遺傳距離為0.000～0.007，平均為0.004；油黑殼菜蛤（Mytilus trossulus） 12個cox1片段核苷酸序列差異較大，遺傳距離為0.000～0.228，平均為0.162，可分成4組，即Mtr1～Mtr4（圖2），4個組的組內遺傳距離依次為0.018、0.005、0.014、0，Mtr1與Mtr2間的遺傳距離為0.159，其余組間遺傳距離為0.212～0.228，雖為同一個種，但差異達到種間差異水平，聚類時也明顯分為4支，這可能是由于Mtr3在資料中標為M型，Mtr3與Mtr1、Mtr2間的分歧是由M、F型線粒體基因組DNA間的差異造成；樣本DQ198225未標明是F型或M型，與其余11個序列的遺傳距離為0.221～0.227，平均為0.220；綠唇貽貝cox1片段（467 bp）共14條，種內遺傳距離為0.000～0.015，平均為0.007。

2.4 貽貝科系統(tǒng)演化關系分析

將從GenBank檢索到的貽貝科403條序列與本試驗39條序列一起進行貽貝科系統(tǒng)發(fā)育分析，因不同學者所用cox1片段序列在cox1全長中的位置和長短不同，經兩頭取齊，共獲得長度為378 bp的單倍型38種，涵蓋13個物種，根據單倍型構建NJ樹。由圖3可見，13個物種隸屬于8個屬，除毛貽貝屬（Trichomya hirsute）與貽貝屬種類交叉聚為1支外，其余各屬均聚為單系支。本試驗新西蘭綠唇貽貝與資料中的綠唇貽貝（DQ917607，AF286188）聚為1支，另一來源的綠唇貽貝（DQ343592）與Perna perna（DQ343595）聚為1支，支持率為100%，這2支合聚為1支，支持率為51%；本試驗的翡翠貽貝與資料中的翡翠貽貝（NC018362）聚為1支，支持率為100%；紫貽貝與加里福尼亞貽貝、毛貽貝聚為1支，貽貝屬與毛貽貝遺傳關系較近；連云港紫貽貝與資料中的紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）[FJ890849（F型）、DQ399833（M型）、NC006886（Mytilus spp.）]和Mytilus edulis（NC006161）聚為單系支，支持率100%，而紫貽貝Mytilus galloprovincialis （FJ890850）M型線粒體cox1與Mytilus edulis（AY823623）線粒體DNA聚為1支。由表3可見，8個屬間的遺傳距離為0.254～0.630，平均為0.486；貽貝屬與Modiolula屬間遺傳距離最大，貽貝屬與毛貽貝屬間遺傳距離最小。

3 結論與討論

3.1 綠唇貽貝的分類地位

貽貝科股貽貝屬目前認定的物種有3種，即新西蘭綠唇貽貝、翡翠貽貝和P. perna （Linnaeus，1758），通過外部形態(tài)很難辯認這3種貽貝[5]。P. perna原產于亞洲西部和南部及南美洲大西洋沿岸，近年來已經入侵墨西哥灣沿海水域；翡翠貽貝自然產于亞洲沿海水域，從波斯灣到中國南方海域，現(xiàn)太平洋島國和墨西哥灣、美國南部的太平洋沿海水域均有發(fā)現(xiàn)；

綠唇貽貝僅產于新西蘭沿海水域。試驗綠唇貽貝樣本（LYB）來源于新西蘭的奧克蘭海域，與股貽貝種類聚為1支，但沒有與資料中的綠唇貽貝（DQ343592）直接聚在一起，綠唇貽貝（DQ343592）與Perna perna （DQ343595）先聚為1支，而后與LYB聚在一起，這說明LYB與資料中提及的綠唇貽貝（DQ343592）親緣關系相對遠，資料中提及的綠唇貽貝樣本同樣采自新西蘭，但具體采集地尚不清?；赾ox1的遺傳距離顯示，Perna perna （DQ343595）與資料中綠唇貽貝（DQ343592）的遺傳距離為0.003，而資料中的綠唇貽貝與LYB的遺傳距離為0.167～0.180，接近Perna perna （DQ343595）和LYB間的距離，試驗綠唇貽貝與資料中提及的綠唇貽貝間遺傳差異大，達到種間差異水平。試驗測定綠唇貽貝的cox1片段序列與大部分綠唇貽貝序列相似性很高，與綠唇貽貝（DQ343592）差異大，因此，綠唇貽貝（DQ343592）的分類地位有待進一步考證。Blair等認為，單獨通過形態(tài)特征，很難辯認股貽貝屬的3種貽貝[5]，而cox1序列分析有助于股貽貝屬種類的識別。