任冬雪 成剛 李濤 王茜 路一平 趙海南(.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院，

河北 廊坊 065001；2.北京燕山玉龍石化工程有限公司， 北京 102500）

0 引言

白芍為茅根科多年生草本芍藥的干燥根。味苦酸，性涼；入肝、脾經(jīng)，對(duì)胸腹脅肋疼痛，瀉痢腹痛，自汗盜汗，陰虛發(fā)熱，月經(jīng)不調(diào)等癥有較好治療效果[1]。白芍的主要成分是芍藥苷，然而芍藥苷的藥用開發(fā)目前還有很多工作要做，如改進(jìn)分離、提取工藝，以獲得更多的有效成分。本試驗(yàn)通過改變芍藥苷前處理方法，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，并通過改變洗脫溶劑，盡可能多的除去雜質(zhì)，以減小試驗(yàn)系統(tǒng)誤差、增加實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度、同樣使樣品得到更好的分離，并延長色譜柱使用壽命，為白芍提取物的含量測(cè)定提供簡(jiǎn)便可行的方法。

1 超高效液相色譜(UPLC）

超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography/UPLC)是分離科學(xué)中的一個(gè)全新類別，其原理與高效液相色譜法基本相同。UPLC借助于HPLC(高效液相色法)的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。目前，超高效液相色譜儀已經(jīng)開始逐漸地投入液相實(shí)驗(yàn)中。主要應(yīng)用于藥物分析(如天然產(chǎn)物中復(fù)雜組分的分析）[2]、生化分析(如蛋白質(zhì)、多肽、代謝組學(xué)等生化樣品）、食品分析(如食品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)）[3]和環(huán)境分析(如水中微囊藻毒素的檢測(cè)）[4]，此外，還用于化妝品中違禁品的檢測(cè)。

超高效液相色譜儀尤其對(duì)中藥研究領(lǐng)域的發(fā)展是一個(gè)極大的促進(jìn)。中藥的組分復(fù)雜，分離困難等問題都可以通過超高效液相色譜法逐漸解決。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與藥品

實(shí)驗(yàn)儀器:萬分之一電子天平；超高效液相色譜儀；Waters UPLC ；Waters T3。

實(shí)驗(yàn)藥品:芍藥苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所提供）；甲醇(分析純）；甲醇(色譜純）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；以甲醇-異丙醇-檸檬酸水溶液(5mol/L）(18∶2∶80）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長240nm；理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。配制流動(dòng)相用甲醇及異丙醇采用色譜純，其余試藥及溶劑采用分析純。

(2）對(duì)照品溶液的制備

精密稱定芍藥苷對(duì)照品10mg，置50ml容量瓶中，加80%甲醇溶解，定容，搖勻，精密量取5ml于50ml的容量瓶中，加80%甲醇制成每1ml含芍藥苷20μg的溶液，搖勻即得。

(3）供試品溶液的制備

取本品 0.08g(天平:萬分之一），精密稱定于25ml容量瓶中，加入80%甲醇適量，超聲處理使充分溶散，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2ml至25ml量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22um濾膜，即得。

(4）測(cè)定法

精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2μL，依次注入超高效液相色譜儀，測(cè)定，根據(jù)色譜圖的積分值按公式進(jìn)行計(jì)算，即得。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 線性和范圍

以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品進(jìn)樣濃度(mg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程相關(guān)系數(shù)r，r≥0.999。

3.2 重復(fù)性

取同一批號(hào)樣品，平行制備6份供試品溶液，并按其色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算6份樣品測(cè)定結(jié)果的RSD值。經(jīng)測(cè)定白芍提取物中芍藥苷的平均含量為75.4mg/g，RSD%=0.61%，重復(fù)性良好。

3.3 穩(wěn)定性

制備對(duì)照品溶液，進(jìn)行對(duì)照品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。分別在0、2、4、8、16、24小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積的RSD 值。經(jīng)計(jì)算芍藥苷對(duì)照品溶液在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)樣峰面積的RSD分別為1.8%，24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

供試品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方法同上，經(jīng)計(jì)算芍藥苷供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)樣峰面積的RSD分別為1.2%，24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 回收率

采用加入50%量的對(duì)照品，以同一批6份樣品測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

取同一批白芍浸膏約0.04g，精密稱定，再分別精密加入濃度為32.02mg/ml的對(duì)照品溶液10ml，相當(dāng)于加入芍藥苷對(duì)照品3.202mg。按照供試品制備方法制備供試品溶液，并進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如下表1。

表1 芍藥苷加樣回收率結(jié)果

結(jié)論:平均回收率為98.2%，RSD為1.4%，準(zhǔn)確度良好。

3.5 耐用性

按照上述實(shí)驗(yàn)方法和條件，分別用2種色譜柱(色譜柱①Waters T3；色譜柱② Waters BEHC18）對(duì)一批樣品芍藥苷含量進(jìn)行測(cè)定，觀察不同色譜柱對(duì)含量測(cè)定的影響。經(jīng)觀察兩種色譜柱測(cè)得芍藥苷含量的相對(duì)平均偏差為0.53%，耐用性良好。

取3批樣品，按同樣方法及色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示樣品測(cè)定中兩份平行相對(duì)樣品的相對(duì)平均偏差均小于2.0，耐用性良好。

表2 耐用性樣品測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)語

本文通過超高效液相色譜法對(duì)白芍浸膏芍藥苷含量測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證，包括線性與范圍、精密度、重復(fù)性、溶液穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性(即回收率）、耐用性及樣品含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示利用UPLC方法測(cè)定芍藥苷的含量有很多優(yōu)點(diǎn)，如可以提高實(shí)驗(yàn)效率，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，減小實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差、增加實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，使樣品得到更好的分離，提高分離度，為白芍提取物含量測(cè)定提供了簡(jiǎn)便可行的方法。

[1]黃兆勝，中藥學(xué)[M].人民衛(wèi)生出版社,2011,452.

[2]王蕓.復(fù)雜天然產(chǎn)物特征組分HPLC篩選方法的研究[M].華東理工大學(xué),2011.

[3]Chen L.G.,Lan D.,Jin H.Y.et al.The determination of organochlorine pesticides based on dymanic microwave-assisted extraction coupled with on-line solid-phase extraction of highperformance liquid chromatography[J].Analytic Chimica Acta,2007,589:239-246.

[4]張立將，尹立紅，等.水中微囊藻毒素高效液相色譜檢測(cè)與前處理?xiàng)l件優(yōu)化[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,3:446-451.