李小慧，鄒 寧，孫東紅，張 軍 (魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264025)

雨生紅球藻是一種廣泛分布在淡水的綠藻，有營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、厚壁孢子兩種。前者是綠色的，處于生長(zhǎng)狀態(tài)，不產(chǎn)生蝦青素，只有在劣勢(shì)條件下厚壁孢子才能夠開始積累類胡蘿卜素，其中80%以上為蝦青素［1］。在雨生紅球藻中，70%的蝦青素以單酯的形式存在，25%以二酯存在，而只有約5%為游離蝦青素［2］。目前，雨生紅球藻的研究及其應(yīng)用受到微藻研究界的重視，但是雨生紅球藻的養(yǎng)殖、生產(chǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，而且雨生紅球藻投入大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，其培養(yǎng)和提取過程中尚存在許多問題亟待研究和解決。

蝦青素(Astaxanthin，3，3’－ 二羥基 －4，4’－ 二酮基 －β，β’－胡蘿卜素，C40H52O4)是一種類胡蘿卜素含氧衍生物，具有超強(qiáng)的抗氧化活性，同時(shí)賦予蝦青素特殊的生理功能，即提高動(dòng)物免疫力，抑制腫瘤，清除自由基和活性氧等［3］。目前蝦青素生產(chǎn)工藝主要有化學(xué)合成和生物提取2種，但化學(xué)合成的蝦青素在結(jié)構(gòu)、功能、應(yīng)用和安全性等方面均較天然蝦青素遜色不少，美國(guó)FDA已明文禁止化學(xué)合成的蝦青素進(jìn)入保健品市場(chǎng)。動(dòng)物和人體試驗(yàn)的結(jié)果已證明，天然蝦青素?zé)o任何毒副作用，對(duì)人體絕對(duì)安全。天然蝦青素具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，不僅可以用作珍貴水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖的餌料添加劑和人類的食品添加劑，而且在藥品、化妝品和高級(jí)營(yíng)養(yǎng)保健品等領(lǐng)域也具有巨大的應(yīng)用潛力。在特定條件下，雨生紅球藻可以積累占其干重1%以上的蝦青素，且所含蝦青素的結(jié)構(gòu)與養(yǎng)殖對(duì)象所需的蝦青素結(jié)構(gòu)一致，因此，雨生紅球藻被公認(rèn)為天然蝦青素的最好生物來源［4］。同時(shí)，利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素已成為國(guó)內(nèi)外蝦青素研究的熱點(diǎn)［5－6］。

雨生紅球藻的培養(yǎng)過程存在不易生長(zhǎng)和易染菌等問題，其色素的提取過程也較困難。常用方法包括有機(jī)溶劑提取、植物油提?。?］及超臨界二氧化碳萃?。?－10］等。植物油提取雖然安全性較高，但植物油沸點(diǎn)高，后期不易分離和處理;超臨界二氧化碳提取法是較流行的方法，但其成本較高［11］。有機(jī)溶劑法具有易操作、控制，且易分離，甚至可以重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，所以目前工業(yè)生產(chǎn)中分離提取蝦青素主要采用有機(jī)溶劑法。該種方法成本低、效率高。在蝦青素的提取過程中，有機(jī)溶劑從雨生紅球藻細(xì)胞中萃取蝦青素的原理是有機(jī)溶劑通過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞，使得色素溶解于有機(jī)溶劑中，從而通過擴(kuò)散作用進(jìn)入溶液。這是一種固—液萃取的過程。雨生紅球藻的細(xì)胞壁很厚且存在膠質(zhì)，阻礙了提取劑向細(xì)胞內(nèi)滲透，因此加大了從其中提取蝦青素的難度。

在有機(jī)溶劑法中，較成熟的是采用丙酮作為提取劑，也是目前常用的有機(jī)溶劑中提取率較高的，但是丙酮的毒性大，且提取過程中易揮發(fā)，因此，筆者研究丙酮與乙醇不同比例提取蝦青素的方法，并且比較不同比例提取的雨生紅球藻蝦青素提取物的提取率，以期探索提取雨生紅球藻中蝦青素較安全、毒性小、有效的有機(jī)溶劑。

1 材料與方法

1.1 材料 供試雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)的新鮮藻液由魯東大學(xué)大境藻類研究所提供。

1.2 蝦青素提取及測(cè)定方法 取樣，測(cè)定蝦青素基礎(chǔ)量。用分光光度計(jì)在可見光λ400～700 nm處測(cè)定OD值，并且通過計(jì)算得出蝦青素含量。經(jīng)多次蝦青素吸光度的標(biāo)定，在波長(zhǎng)為473 nm處蝦青素的吸光度達(dá)到峰值，因此，試驗(yàn)中蝦青素的吸光度均在波長(zhǎng)473 nm下測(cè)定(理論值為475 nm)。

蝦青素含量的測(cè)定步驟為:①將冷凍的新鮮藻膏提前放入保鮮里，用電子天平稱取8支離心管，并且編號(hào)1～8，分別記下其質(zhì)量M1～M8，用移液管分別吸取少量新鮮藻膏，置于潔凈的離心管中，再次分別稱量其質(zhì)量M1’～M8’，并且計(jì)算出M’與M的質(zhì)量差即鮮藻膏的質(zhì)量;②向1～8號(hào)離心管中分別加入有機(jī)溶劑1 ml，再加入少量(8～12個(gè))玻璃珠，在振蕩混勻器上振蕩混勻，在振蕩混勻過程中用鋁箔包住離心管，邊振蕩邊觀察，振蕩完成后再加入2 ml提取劑振蕩混勻，提取過程需進(jìn)行3次，以保證充分提取出雨生紅球藻細(xì)胞中的蝦青素，在不同比例的試驗(yàn)中均用乙醇和丙酮兩管作對(duì)照，剩下不同試驗(yàn)中分別為1∶1(V/V)、2∶1(V/V)、1∶2(V/V);③先將提取液1～8號(hào)離心管放入80℃的水浴中加熱1 min，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到0～4℃的條件下冰浴1 h;④將冰浴后的提取液在4 000 r/min的條件下離心5 min，取上清液，分別轉(zhuǎn)移至1～8號(hào)10 ml定容管中;⑤重復(fù)②～④步驟3次，將3次提取的上清液合并，每次分別移入相同編號(hào)的定容管中，并且定容至10 ml，混勻，在波長(zhǎng)400～700 nm的可見光范圍內(nèi)測(cè)定其吸光度，并且記錄所測(cè)得的數(shù)值;⑥不同比例的各試驗(yàn)重復(fù)5次，然后將1∶1、2∶1、1∶2丙酮放在 1個(gè)試驗(yàn)中，重復(fù)5次。

1.3 蝦青素含量的計(jì)算方法 在473 nm波長(zhǎng)下測(cè)定最大吸光度值，以提取劑作為空白對(duì)照。如果吸光度值大于1.25，則必須對(duì)樣品用提取劑稀釋后再測(cè)，稀釋倍數(shù)一般為1∶7。用下列公式計(jì)算所測(cè)溶液中蝦青素含量:若原料為新鮮藻類培養(yǎng)液，則用蝦青素(mg/L)=［4×OD(λ473)×丙酮的體積］/藻液的體積，葉綠素(mg/L)=［12.7×OD(λ664)－2.69×OD(λ647)］×稀釋倍數(shù);若原料為新鮮藻膏，則用蝦青素(mg/g)=［4×OD(λ473)×丙酮的體積］/(鮮藻膏的質(zhì)量×藻膏的干重)。

1.4 新鮮藻膏干重的測(cè)定方法 將稱量紙置于培養(yǎng)皿中，于80℃下烘干12 h至恒重，記錄稱量紙的質(zhì)量(m1);用膠頭滴管吸取藻液，同樣置于培養(yǎng)皿中，于80℃下烘干12 h至恒重，記錄其質(zhì)量(m2)。

鮮藻的干重公式為:m=m2－m1

采用該方法最終測(cè)得所用鮮藻的平均干重為(103.6±0.52)mg/g。

1.5 蝦青素的吸收光譜 蝦青素在不同的分光光度計(jì)下的最大吸收波長(zhǎng)不同，所以在采用此分光光度計(jì)測(cè)定蝦青素含量時(shí)，需要對(duì)蝦青素的最大吸收波長(zhǎng)的結(jié)果進(jìn)行校對(duì)。采用分光光度計(jì)測(cè)定蝦青素在可見光范圍內(nèi)的吸光光度值。經(jīng)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)當(dāng)波長(zhǎng)為473 nm(理論值為475)時(shí)吸收光譜達(dá)到最大。

2 結(jié)果與分析

由圖1可知，乙醇/丙酮為1∶2(V/V)時(shí)蝦青素的提取率為 15.59 mg/g，丙酮的提取率為15.06 mg/g，乙醇/丙酮為1∶1(V/V)時(shí)提取率為12.72 mg/g，乙醇/丙酮為2∶1(V/V)時(shí)提取率為12.47 mg/g，乙醇的提取率為 10.11 mg/g。由此可知，乙醇/丙酮為1∶2(V/V)時(shí)提取率最高，其次為丙酮。

研究表明，乙醇/丙酮為1∶2(V/V)時(shí)提取率最高。用添加乙醇來降低丙酮單獨(dú)作提取劑的毒性，與丙酮作提取劑時(shí)蝦青素的提取率要高，雖然與丙酮作有機(jī)溶劑相比不是特別顯著，但仍達(dá)到預(yù)期效果，與乙醇作提取劑相比提高近50%倍，效果還是很明顯的。

圖1 不同比例有機(jī)溶劑提取率比較

目前，對(duì)蝦青素的提取主要是通過有機(jī)溶劑浸提的方法。該方法操作簡(jiǎn)便易行，成本低，后期易分離和獲取。常用有機(jī)溶劑是丙酮，其操作較完善和成熟。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn)使得試驗(yàn)更具說服力。雨生紅球藻在不良條件下才開始產(chǎn)生蝦青素，同時(shí)為了度過劣勢(shì)環(huán)境會(huì)產(chǎn)生厚壁孢子。在提取蝦青素時(shí)加入丙酮和乙醇。丙酮是極性較強(qiáng)的溶劑，蝦青素溶解度較低，親水性溶劑乙醇滲入細(xì)胞中將蝦青素溶解到有機(jī)溶劑中，從而提高提取效率，因而選擇乙醇和丙酮混合作有機(jī)溶劑來提取雨生紅球藻中的蝦青素。這也是比較理想的有機(jī)混合溶劑。

3 結(jié)論與討論

有機(jī)溶劑通過細(xì)胞壁滲入細(xì)胞，使得蝦青素溶解在有機(jī)溶劑中，并且通過擴(kuò)散作用進(jìn)入有機(jī)溶劑的溶液中。這是一種固－液萃取的過程。含有蝦青素的細(xì)胞是厚壁細(xì)胞。細(xì)胞壁太厚，有膠質(zhì)層，便會(huì)影響有機(jī)溶劑分子進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)影響蝦青素溶液的擴(kuò)散效果［12］。因此，試驗(yàn)前必須先進(jìn)行破壁處理，破壞其細(xì)胞機(jī)構(gòu)，從而利用有機(jī)溶劑將蝦青素提取出來，大大提高其提取效率。

試驗(yàn)中，用新鮮藻膏為原料，干重為103.6 mg/g，濃度較新鮮藻液要高，提取效率有所提高，但新鮮藻膏也保存在冷凍環(huán)境。在每次試驗(yàn)前，都要提前將其放入保鮮環(huán)境融化，或置于室溫，但要注意避光，以防止蝦青素被氧化，造成試驗(yàn)誤差。該研究對(duì)有機(jī)溶劑的比例進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后效果明顯。當(dāng)乙醇/丙酮為1∶2時(shí)效果最明顯，是乙醇作有機(jī)溶劑的1.5倍多，也較丙酮作有機(jī)溶劑時(shí)的效果要好些，從而篩選出最佳配比。乙醇無(wú)毒，能降低丙酮作溶劑毒性，具有更大優(yōu)勢(shì)。這兩種溶劑均易獲取，而且操作簡(jiǎn)便易行。在整個(gè)試驗(yàn)中，一定要注意控制溫度、避光，以免使蝦青素被氧化，影響提取效果。試驗(yàn)所用乙醇和丙酮這兩種提取劑的原料廉價(jià)易得，也沒有增加后續(xù)分離操作的困難，最重要的是提取效果更好。

該研究對(duì)有機(jī)溶劑比例的優(yōu)化具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，既降低生產(chǎn)成本，又提高生產(chǎn)效率，降低毒性，提升提取率，比丙酮和乙醇單獨(dú)作提取劑有更大的優(yōu)勢(shì)。這對(duì)日后大規(guī)模生產(chǎn)具有參考價(jià)值。

［1］LORENZ R T，CYSEWSKI G R.Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin［J］.Tibtech Appil，2000，18:160－167.

［2］MIAO F P，LU D Y，LI Y G，et al.Characterization of astaxanthin esters in Haematococcus pluvialis by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry［J］.Analytical biochemistry，2006，352(2):176－181.

［3］孟春曉，高政權(quán)，王依濤，等.雨生紅球藻中蝦青素提取方法研究現(xiàn)狀［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2010，29(12):745 －748.

［4］邱昌恩.6-BA對(duì)平菇和香菇菌絲體兩種同工酶的影響［J］.微生物學(xué)雜志，2002，22(4):89 －92.

［5］王秀奇，秦淑媛，高天慧，等.基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:高等教育出版社，1999:227－232.

［6］季維智，宿兵.遺傳多樣性研究的原理與方法［M］.杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1999:52 －68.

［7］KANG C D，SIM S J.Directextraction of astaxanthin from Haematococcus culture using vegetable ils［J］.Biotechnology letters，2008，30(3):441 －444.

［8］KRICHNAVARUK S，SHOTIPRUK A，GOTO M，et al.Supercritical carbon dioxide extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis with vegetable oils as co-solvent［J］.Bioresource technology，2008，99(13):5556 －5560.

［9］MACHMUDAH S，SHOTIPRUK A，GOTO M，et al.Extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis using supercritical CO2and ethanol as entrainer［J］.Industrial ＆ engineering chemistry research，2006，45(10):3652 －3657.

［10］NOBRE B，MARCELO F，PASSOS R，et al.Supercritical carbon dioxide extraction of astaxanthin and other carotenoids from the microalga Haematococcus pluvialis［J］.European food research and technology，2006，223(6):787－790.

［11］李婷，韓麗君，袁毅.不同有機(jī)溶劑對(duì)雨生紅球藻中蝦青素提取成分的影響［J］.海洋科學(xué)，2012，36(7):34 －38.

［12］陳峰，姜悅.微藻生物技術(shù)［M］.2版.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999:256 －267.