梁 波 (廣東省中山市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東中山 528403)

生物胺廣泛存在于各種動(dòng)植物組織中，在人和動(dòng)物活性細(xì)胞中發(fā)揮著重要生理作用，但當(dāng)攝入過(guò)量時(shí)，會(huì)引起頭痛、呼吸困難、心悸等過(guò)敏反應(yīng)和癥狀。因此在動(dòng)物源性食品生產(chǎn)過(guò)程中，必須減少其中生物胺的含量才能生產(chǎn)出更為安全的食品。廣式臘味制品以其獨(dú)特的風(fēng)味，深受粵港澳地區(qū)廣大群眾歡迎，但人們更希望在享受美味的同時(shí)能夠吃到放心肉，而生物胺的含量便作為肉制品原料新鮮度的指標(biāo)越來(lái)越受到食品安全工作者的關(guān)注。由于生物胺分子中缺少發(fā)色基團(tuán)，無(wú)紫外吸收、也無(wú)熒光及電化學(xué)活性，因此傳統(tǒng)的比色、滴定等方法在檢測(cè)生物胺方面存在一定的困難。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦方法是采用酶生物傳感器法、電泳法、薄層色譜法紫外分光光度計(jì)或者高效液相色譜法(HPLC)等，其中GB/T5009．208采用HPLC測(cè)定食品中生物胺含量，但該方法存在需要進(jìn)行柱前或柱后衍生，反應(yīng)條件苛刻，前處理耗時(shí)較長(zhǎng)以及陽(yáng)性樣品無(wú)法確證等不足。近年來(lái)，超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)儀由于效率高、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越多地被用于食品污染物和營(yíng)養(yǎng)成分的檢測(cè)。基于此，筆者將采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜研究能測(cè)定廣式臘味中多種生物胺含量的新方法。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 原料與試劑。供試樣品為市場(chǎng)上某品牌臘魚。主要試劑:三氯乙酸，1%;甲酸，色譜純，德國(guó)Merck公司;甲醇、氨水，色譜純;組胺、尸胺、色胺、腐胺、2-苯乙胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、1，7庚二胺內(nèi)標(biāo)物，德國(guó)Dr．Ehrenstorfer Gmbhgong公司;試驗(yàn)用水均為超純水。

主要儀器:超高效液相色譜－串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó) WATERS公司(UPLC-XevoTQ);分析天平，感量為0．000 1 g和 0．01 g，賽多利斯;冷凍離心機(jī)，德國(guó)(Sigma3-18k);具塞塑料離心管:50 ml;色譜柱，ACQUITY UPLCr HSS C181．7或同等性能色譜柱;中性氧化鋁固相萃取小柱，菲羅門公司;氮吹儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1．2 儀器工作條件 色譜－質(zhì)譜條件:流速0．4 ml/min，柱溫40℃，樣品溫度15℃，流動(dòng)相為A(0．01%甲酸水+0．05氨水水溶液)－B(0．1%甲酸甲醇)，梯度洗脫程序?yàn)?～0．75 min 60%A ～ 40%B，0．75 ～ 1．00 min 60%A ～ 40%B，1．00 ～1．25 min 30%A ～70%B，1．90 ～3．80 min 90%A ～10%B，3．80 ～5．00 min 90%A ～10%B。離子源:電噴霧離子化源(ESI);掃描模式:正離子掃描;離子源溫度:150℃;脫溶劑溫度:550℃;脫溶劑氣(N2)，流量:1 000 L/H;毛細(xì)管電壓:0．5 kV。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 樣品的提取。準(zhǔn)確稱取樣品1～2 g至50 ml離心管中，加入濃度為1 000 μg/L 1，7-庚二胺(內(nèi)標(biāo))100 μl，渦旋混勻，加入5 ml 0．01%甲酸水+0．05%氨水甲醇溶液渦旋振蕩提取，于10 000 r/min離心機(jī)離心3 min，取上清液，重復(fù)提取2次，合并提取清液，常溫下氮?dú)獯蹈?，? ml 1%甲酸甲醇溶液溶解，溶解液備用。

1．3．2 樣品凈化。用2 ml甲醇、2 ml去離子水活化中性氧化鋁固相萃取小柱，將上述溶解液加入小柱內(nèi)，控制流速，收集流出液，常溫下氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相定容至1 ml，然后過(guò)0．22 μm濾膜進(jìn)行色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 樣品的提取與凈化 為了更充分地提取待測(cè)物質(zhì)，所以該方法選擇用少量流動(dòng)相多次重復(fù)提取的方法以達(dá)到最佳提取效果。同時(shí)在待測(cè)樣品中加入內(nèi)標(biāo)物，減少前處理過(guò)程中造成待測(cè)物質(zhì)的損失所導(dǎo)致結(jié)果偏低的誤差。在樣品凈化方面選用了中性氧化鋁固相萃取小柱，除去一些油脂類的雜質(zhì)等。

2．2 色譜條件的選擇 流動(dòng)相的組成和比例既影響物質(zhì)的分離又影響靈敏度。由于待測(cè)的化合物在質(zhì)譜方面正負(fù)兩種離子模式下哪種響應(yīng)較強(qiáng)未知，經(jīng)研究流動(dòng)相選擇發(fā)現(xiàn)0．01%甲酸水+0．05%氨水溶液和甲醇最理想，采用梯度洗脫讓化合物分離更好、峰型更好。

圖1 5種生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液UPLC-M S/MS

2．3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 將標(biāo)準(zhǔn)混合液直接引入質(zhì)譜進(jìn)行調(diào)諧，分別在正負(fù)兩種離子模式下進(jìn)行母離子全掃描。結(jié)果表明，待測(cè)化合物在正離子掃描模式下響應(yīng)值較高，因此以正離子模式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描獲得子離子質(zhì)譜信息，選擇兩個(gè)豐度較高而且穩(wěn)定的子離子作為定性離子和定量離子，得到每種物質(zhì)的最佳質(zhì)譜參數(shù)(圖1)。

但由于流動(dòng)相選擇了0．01%甲酸水+0．05%氨水溶液和甲醇溶液，將毛細(xì)管電壓逐步調(diào)低(常用為3．0 kV)，發(fā)現(xiàn)待測(cè)化合物得到的響應(yīng)值都較常用的3．0 kV高，因此最終將毛細(xì)管電壓調(diào)低到0．5 kV，得到很好的效果，見(jiàn)表1。

2．4 線性范圍與檢出限 配制不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜，記錄色譜峰面積，以質(zhì)量濃度Y為縱坐標(biāo)，色譜峰面積X為橫坐標(biāo)作校正曲線，得到線性回歸方程，由于日常產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中組胺的標(biāo)準(zhǔn)判定值較高，而且檢測(cè)儀器是液質(zhì)聯(lián)用，因此筆者選用5種化合物濃度在200．0～600．0 μg/L范圍。在此范圍內(nèi)其線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0．999，線性方程和檢出限見(jiàn)表2。

表1 MRM監(jiān)測(cè)模式下質(zhì)譜優(yōu)化條件

表2 5種生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2．5 方法回收率與精密度 在不含待測(cè)化合物的臘魚樣品中添加3個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按“2．1”或“2．2”前處理后進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)6次，見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，供試臘魚中5種生物胺的加標(biāo)回收率在86．6% ～91．6%。

2．6 實(shí)際樣品測(cè)定 利用該研究分析方法對(duì)50個(gè)臘腸樣品、10個(gè)臘魚樣品、10個(gè)速凍水產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)定，其中8個(gè)樣品檢出生物胺，檢出含量為 0．5～6．0 mg/kg，均少于 10 mg/kg。

表3 5種生物胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在樣品中的加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

從超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)5種生物胺的結(jié)果可見(jiàn)，超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定廣式臘味制品中組胺、尸胺、色胺、腐胺、2-苯乙胺的新方法靈敏度高，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，方法精密度高，尤其比液相色譜法更節(jié)省時(shí)間。由于前處理?xiàng)l件比較簡(jiǎn)單，再通過(guò)用內(nèi)標(biāo)法定量，既能排除假陽(yáng)性干擾，又能減少系統(tǒng)誤差且定量準(zhǔn)確，使用此方法檢測(cè)廣式臘味中組胺、尸胺、色胺、腐胺、2-苯乙胺能大大提高日常檢測(cè)工作效率，建議在檢測(cè)機(jī)構(gòu)和相關(guān)企業(yè)中應(yīng)用和推廣。

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