黃玉蘭 (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江大慶163319)
黃瓜(Cucumis sativus L.)是葫蘆科黃瓜屬1年生蔓生草本植物,是我國主要的蔬菜作物之一。黃瓜播種面積和總產(chǎn)量在我國主要蔬菜中位居前列[1]。近年來,隨著我國保護(hù)地黃瓜栽培面積的逐漸擴(kuò)大,黃瓜病害、連作障礙和種性退化現(xiàn)象嚴(yán)重[2]。因此,“優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗、生態(tài)、高效”黃瓜新品種的選育迫在眉睫。農(nóng)藥作為補(bǔ)救性措施雖然得到了廣泛的應(yīng)用,同時(shí)也帶來了農(nóng)藥殘留和人體內(nèi)毒性積累的問題。為適應(yīng)不良環(huán)境,植物本身有多種反擊有害生物侵害的方法,利用次級(jí)代謝產(chǎn)物驅(qū)蟲,阻止病菌的侵染就是一種重要的化學(xué)防御措施,其中黃酮類和三萜類皂苷是植物抗病蟲侵害的2類重要的次生代謝物質(zhì)[3-5]。
絞股藍(lán)(Gynostemma pentaphyllum)是多年生蔓生藤本,為葫蘆科植物,有“南方人參”和“第二人參”的美譽(yù),別名小苦藥、公羅鍋底、五葉藤、遍地生根、甘茶蔓等[6-7]。有研究表明,絞股藍(lán)黃酮類和三萜類化合物的含量較高,絞股藍(lán)中僅8種黃酮含量就高達(dá)2.4 mg/g,僅18種三萜類皂苷含量高達(dá)89.9 mg/g[8]。林毅等研究表明,中草藥絞股藍(lán)具有廣譜的抗植物病毒活性和抵抗多種植物病原真菌以及農(nóng)業(yè)害蟲的活性,為培育抗病蟲作物新品種提供了新資源[9]。如果將絞股藍(lán)黃酮和三萜類化合物高效的合成能力及抗病蟲能力轉(zhuǎn)移到黃瓜上,黃瓜的抗病蟲防衛(wèi)能力將有可能增強(qiáng)。為此,筆者通過植物外源遺傳物質(zhì)動(dòng)態(tài)導(dǎo)入法[9],選取絞股藍(lán)染色體作為供體,黃瓜原生質(zhì)體作為受體,采用電擊法將絞股藍(lán)染色體轉(zhuǎn)至黃瓜原生質(zhì)體細(xì)胞中,研究了其調(diào)控黃瓜次生代謝產(chǎn)物的作用,以期為黃瓜育種工作提供參考。
1.1 材料
1.1.1 供試植物。絞股藍(lán)種子購自安康平利縣百草堂科技有限公司絞股藍(lán)種質(zhì)資源圃基地;黃瓜品種“津研4號(hào)”由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。
1.1.2 試劑。甘露醇(天津市福晨化學(xué)試劑廠)、纖維素酶(Onozuka R-10,日本 Yakult公司)、果膠酶(Macerozyme R-10,日本 Yakult公司)。
1.1.3 儀器。HZS-H水浴振蕩器;UV-2100型紫外可見分光光度計(jì);GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī);TGL-16G臺(tái)式離心機(jī);恒壓、恒流DF-D電泳儀;UV-ⅥA型紫外透射反射儀;Shimadzu LC2010HT高效液相色譜儀、LCsolution色譜工作站(日本島津公司);多功能細(xì)胞電穿孔儀。
1.2 方法
1.2.1 絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及莖段染色體片段的分離制備[10-11]。取絞股藍(lán)無菌苗的葉片和莖段為外植體,切成0.5 cm小段培養(yǎng)在1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA組合的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織常規(guī)誘導(dǎo),選擇最佳的激素配比進(jìn)行愈傷組織的增殖培養(yǎng),調(diào)控6-BA和NAA的濃度將增殖培養(yǎng)的愈傷組織繼代培養(yǎng)成胚性愈傷組織。將胚性愈傷組織接種液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng),獲得絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞。
取相對(duì)飽滿的懸浮細(xì)胞用質(zhì)量百分比為0.1%的秋水仙素處理16 h,用MS培養(yǎng)基洗滌后稱10 g放入100 ml裂解液中,解離絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜10 h;采用蔗糖密度梯度離心對(duì)懸浮細(xì)胞細(xì)胞核純化,過濾,1 500×g離心濃縮細(xì)胞核,低溫保存;將收集到的細(xì)胞核用75 mmol/L氯化鉀4℃低滲10 min,1 000 r/min離心10 min,沉淀懸于0.75 mol/L 1,6-己二醇的CPW緩沖溶液上37℃水浴10 min,再用7號(hào)針頭10 ml注射器推擠。將染色體溶液置于25%蔗糖溶液中,500×g離心60 min,大量染色體都集中在25%蔗糖界面上。
1.2.2 黃瓜原生質(zhì)的制備與純化。選取植株頂端未充分展開的幼嫩子葉,用清水沖洗干凈,75%乙醇浸泡數(shù)秒,再用0.1%HgCl2溶液消毒7 min,然后用無菌水清洗4~5次,撕下葉片下表皮,并將去掉下表皮一面置于盛有酶液培養(yǎng)皿中,在黑暗條件下25℃恒溫?fù)u床上50 r/min振蕩,以分離原生質(zhì)體。
1.2.3 絞股藍(lán)染色體片段轉(zhuǎn)染黃瓜原生質(zhì)體。受體:黃瓜原生質(zhì)體。DNA供體:分離純化的染色體。采用多功能細(xì)胞電穿孔儀器。使用參數(shù):脈沖電壓100~500 V,脈沖時(shí)間20~100 μs,脈沖寬度20 ~60 μs,脈沖次數(shù)1 ~5。電轉(zhuǎn)染緩沖液:0.5 mol/L 蔗糖、10 mmol/L CaCl2,10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4(pH 6.0)和0.03% 葡聚糖硫酸鉀。用轉(zhuǎn)染緩沖液調(diào)整原生質(zhì)體或細(xì)胞核濃度至1×107~5×107個(gè)/ml,取0.8 ml于每個(gè) Eppendorf管中,加入10~50 μg供體染色體,混勻,置冰上10 min。然后將原生質(zhì)體-染色體懸液轉(zhuǎn)入電擊小室,迅速放入電融合儀進(jìn)行脈沖電擊,將轉(zhuǎn)染后收集原生質(zhì)體進(jìn)行看護(hù)培養(yǎng)。
1.2.4 轉(zhuǎn)染子的培養(yǎng)與再生愈傷組織的誘導(dǎo)。以平皿固體培養(yǎng)基上生長旺盛的黃瓜愈傷細(xì)胞為看護(hù)者,其上覆蓋2張中速濾紙,將轉(zhuǎn)染子與融合子置于其上培養(yǎng)。經(jīng)過篩選培養(yǎng)條件:黑暗,(25±1)℃,空氣相對(duì)濕度為60% ~70%。培養(yǎng)基為KM8P添加0.5 mol/L甘露醇、30 g/L葡萄糖、0.03%葡聚糖硫酸鉀、0.5 mg/L 2,4-D 和 1.0 mg/L 6-BA。培養(yǎng) 15 ~30 d后,2,4-D減半,甘露醇減半,調(diào)控不同的激素濃度誘導(dǎo)出再生愈傷組織。
1.2.5 再生愈傷組織中總黃酮和人參皂苷Rb1檢測(cè)。采用分光光度法,以蘆丁對(duì)照品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,于510 nm波長下比色定量測(cè)定再生愈傷組織中總黃酮吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),得蘆丁濃度(Y)與吸光度(A)的關(guān)系曲線的回歸方程:Y=0.101 7A-0.001 6。相關(guān)系數(shù) r=0.998 2,蘆丁濃度與吸光度有良好的相關(guān)性。
采用HPLC法,以流動(dòng)相為乙腈(a)-水(b)梯度洗脫(0~10 min,15%a→20%a;10 ~40 min,20%a→40%a;40 ~60 min,40%a~15%a),流速為1 ml/min,檢測(cè)波長為203 nm,柱溫30℃的條件對(duì)標(biāo)品和各樣品進(jìn)行梯度洗脫,測(cè)其再生愈傷組織人參皂苷Rb1的含量。
2.1 絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及染色體的分離 在優(yōu)化的培養(yǎng)基上對(duì)絞股藍(lán)愈傷組織進(jìn)行細(xì)胞的懸浮培養(yǎng),懸浮細(xì)胞可不斷增殖,狀態(tài)良好。其胚性愈傷組織培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞見圖1。將絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞預(yù)處理和酶解去除細(xì)胞壁細(xì)胞膜,經(jīng)抽濾、自然沉降、離心等方法得到絞股藍(lán)染色體(圖2)。
2.2 黃瓜原生質(zhì)體的制備分離與純化 圖3是由懸浮培養(yǎng)的“津研4號(hào)”黃瓜胚性細(xì)胞經(jīng)酶解制備的原生質(zhì)體,原生質(zhì)體的產(chǎn)率和完整率都較高,獲得了高質(zhì)量的原生質(zhì)體,建立了黃瓜原生質(zhì)體的制備和培養(yǎng)等方法。
圖1 絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞
圖2 絞股藍(lán)染色體
2.3 轉(zhuǎn)染子的培養(yǎng)與再生愈傷組織的誘導(dǎo) 轉(zhuǎn)染后的原生質(zhì)體培養(yǎng)采用的是固體薄層培養(yǎng)法,將3~4 ml的原生質(zhì)體按照一定細(xì)胞密度(1×104~1×105個(gè)/L)與等體積的處于45℃的瓊脂培養(yǎng)基混合,在培養(yǎng)皿中制成薄層固體平板,在含0.5 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA 的MS 固體培養(yǎng)基上長成結(jié)構(gòu)致密的帶綠點(diǎn)大塊愈傷組織(圖4)。
圖3 純化的原生質(zhì)體
2.4 愈傷組織中黃酮化合物含量的測(cè)定 由表1可知,侵染絞股藍(lán)DNA的再生黃瓜愈傷組織中總黃酮含量高于對(duì)照組,其再生愈傷組織總黃酮含量高達(dá)1.248%,比對(duì)照組高出4.38%,也明顯高于蔡健等測(cè)得的含量[12]。
2.5 再生愈傷組織人參皂苷Rb1含量的測(cè)定 測(cè)定結(jié)果表明,侵染絞股藍(lán)黃瓜愈傷組織中含有絞股藍(lán)人參皂苷Rb1達(dá)(0.92 ±0.07)mg/g,雖然含量很低,但可以說明絞股藍(lán)中某些成分對(duì)黃瓜的次級(jí)代謝產(chǎn)物起了一定的作用,具體如何調(diào)控還有待于進(jìn)一步研究。
圖4 再生愈傷組織
表1 愈傷組織中黃酮化合物含量的比較
圖5 絞股藍(lán)皂苷Rb1標(biāo)品色譜
圖6 轉(zhuǎn)染組愈傷組織樣品色譜
轉(zhuǎn)染組愈傷組織樣品液相色譜分離情況按“1.2.5”色譜條件測(cè)定,比較人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品及轉(zhuǎn)染組色譜(圖5、6),可以看出在該試驗(yàn)條件下色譜峰分離良好。在保留時(shí)間為11.198 min時(shí)出現(xiàn)人參皂苷Rb1的峰值,是否存在其他皂苷還有待于進(jìn)一步研究。
2.5.1 線性關(guān)系的考察。分別取絞股藍(lán)皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品5、10、15、20 和 25 μl進(jìn)樣,在相同條件下測(cè)定,以峰面積(y)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸曲線性方程:y=324 161x-244 034,r=0.999 8,表明進(jìn)樣量在 0.5 ~2.5 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.5.2 精密度試驗(yàn)。量取對(duì)照溶液,按“1.2.5”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次,測(cè)定峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.02%。
2.5.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)。取供試品1份,按供試品溶液制備方法平行制備5份并測(cè)定。測(cè)定含量的RSD為2.18%,表明重現(xiàn)性較好。
2.5.4 回收率試驗(yàn)。取同一樣品6份,分別加入人參皂苷Rb1對(duì)照品2 mg,按照供試品溶液制備方法,進(jìn)樣10 μl,測(cè)定含量,計(jì)算平均回收率為98.20%,RSD為2.20%。
2.5.5 含量測(cè)定。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染組愈傷組織人參皂苷Rb1含量為 1.04 mg/g。
外源DNA導(dǎo)入一些物種可以達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的,其可靠性和可行性已經(jīng)在水稻、野生大豆外源DNA導(dǎo)入研究中得到驗(yàn)證[13-15]。而絞股藍(lán)和黃瓜同屬葫蘆科植物,在次生代謝的調(diào)節(jié)上有很多共同之處,它們的甲羥戊酸途徑是比較活躍的,能夠較好地合成距離人參皂苷非常近的前體物2,3-氧化鯊烯[16]。然而絞股藍(lán)在黃酮和皂苷上的代謝上要遠(yuǎn)比黃瓜活躍。
該研究將絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞預(yù)處理和酶解去除細(xì)胞壁細(xì)胞膜,經(jīng)抽濾、自然沉降、離心等方法得到絞股藍(lán)染色體,為絞股藍(lán)染色體轉(zhuǎn)染黃瓜原生質(zhì)體提供了較好的受體。試驗(yàn)結(jié)果表明,黃酮含量高于對(duì)照組,轉(zhuǎn)染組愈傷組織中黃酮含量比對(duì)照組高出4.38%。而且在轉(zhuǎn)染組還含有人參皂苷Rb1,雖然含量較低,但可以說明絞股藍(lán)種皂苷成分可能對(duì)黃瓜的次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)控起了一定的作用,可能就是甲羥戊酸途徑中距離人參皂苷非常近的前體物——2,3-氧化鯊烯所調(diào)控,具體的調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。
該研究采用電轉(zhuǎn)染試圖將絞股藍(lán)染色體轉(zhuǎn)染至黃瓜原生質(zhì)體,并經(jīng)過經(jīng)看護(hù)培養(yǎng)誘導(dǎo)出再生愈傷組織,經(jīng)分光光度檢測(cè)轉(zhuǎn)染組黃酮含量比對(duì)照組高,尤其是再生黃瓜愈傷組織中檢測(cè)到絞股藍(lán)人參皂苷Rb1。利用該項(xiàng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)作物科間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移在一定條件下是可能的,同時(shí)為黃瓜的種質(zhì)資源創(chuàng)新及育種提供了理論與技術(shù)依據(jù)。
[1]吳雪霞,查丁石,楊少軍.我國黃瓜育種研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010(9):53-55.
[2]武濤,秦智偉,周秀艷,等.轉(zhuǎn)基因技術(shù)在黃瓜性狀改良中的應(yīng)用及戰(zhàn).略思考[J].中國蔬菜,2010(20):1-8.
[3]AUGUSTIIN J M,KUZINA V,ANDERSEN S B,et al.Molecular activities,biosynthesis and evolution of triterpenoid saponins[J].Phytochemistry,2011,72(6):435 -457.
[4]MAKOI J H J R,CHIMPHANGO S B M,DAKORA F D.Seed flavonoids and anthocyanins as markers of enhanced plant defence in nodulated cowpea(Vigna unguiculata L.Walp.)[J].Field Crops Research,2010,118(1):21 -27.
[5]TI X,ZHANG Q.Advances in research of induced resistance to insects in cotton[J].Frontiers of Biology in China.2009,4(3):289 -297.
[6]何顯忠,邱江沁.絞股藍(lán)化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜,2008,5(S1):84.
[7]李金青,楊洪軍.絞股藍(lán)的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2009,3(7):189.
[8]KAO T H,HUANG S C,INBARAJ B S.Determination of flavonoids and saponins in Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino by liquid chromatography-mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2008,626(2):200-211.
[9]朱培坤.高等植物染色體雜交[M].濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社,2011.
[10]葉金山,溫強(qiáng),江香梅,等.殼斗科5屬植物基因組DNA提取方法研究[J].江西林業(yè)科技,2008(6):10 -12.
[11]鞏艷紅.劉軍.張健,等.毛豹皮樟的葉片DNA提取及其RAPD引物篩選[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2004,19(4):35 -37.
[12]蔡健,王薇.黃瓜葉中總黃酮含量的研究[J].食品科學(xué),2005,26(8):194-497.
[13]羅忠訓(xùn),萬樹青,夏桂先,等.未傳粉子房顯微注射向水稻轉(zhuǎn)移外源基因的研究[J].科學(xué)通報(bào),1987,32(11):863 -865.
[14]CHRISTOU P.Production of transgene rice plant from agrinomically important inlica and japonica via electric discharge partical acceleration of exogenous DNA into immature zygoyic embryos[J].Bio/Technology,1991,9:91 -96.
[15]雷勃鈞,尹光初,盧翠華,等.外源DNA直接導(dǎo)入大豆的研究[J].大豆科學(xué),1991,10(10):58 -63.
[16]郜玉鋼,王亞星,臧埔,等.人參皂苷生物合成途徑的初步研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2011(10):2422-2423.