黃玉蘭 (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶163319)

黃瓜(Cucumis sativus L．)是葫蘆科黃瓜屬1年生蔓生草本植物，是我國主要的蔬菜作物之一。黃瓜播種面積和總產(chǎn)量在我國主要蔬菜中位居前列［1］。近年來，隨著我國保護(hù)地黃瓜栽培面積的逐漸擴(kuò)大，黃瓜病害、連作障礙和種性退化現(xiàn)象嚴(yán)重［2］。因此，“優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗、生態(tài)、高效”黃瓜新品種的選育迫在眉睫。農(nóng)藥作為補(bǔ)救性措施雖然得到了廣泛的應(yīng)用，同時(shí)也帶來了農(nóng)藥殘留和人體內(nèi)毒性積累的問題。為適應(yīng)不良環(huán)境，植物本身有多種反擊有害生物侵害的方法，利用次級(jí)代謝產(chǎn)物驅(qū)蟲，阻止病菌的侵染就是一種重要的化學(xué)防御措施，其中黃酮類和三萜類皂苷是植物抗病蟲侵害的2類重要的次生代謝物質(zhì)［3－5］。

絞股藍(lán)(Gynostemma pentaphyllum)是多年生蔓生藤本，為葫蘆科植物，有“南方人參”和“第二人參”的美譽(yù)，別名小苦藥、公羅鍋底、五葉藤、遍地生根、甘茶蔓等［6－7］。有研究表明，絞股藍(lán)黃酮類和三萜類化合物的含量較高，絞股藍(lán)中僅8種黃酮含量就高達(dá)2．4 mg/g，僅18種三萜類皂苷含量高達(dá)89．9 mg/g［8］。林毅等研究表明，中草藥絞股藍(lán)具有廣譜的抗植物病毒活性和抵抗多種植物病原真菌以及農(nóng)業(yè)害蟲的活性，為培育抗病蟲作物新品種提供了新資源［9］。如果將絞股藍(lán)黃酮和三萜類化合物高效的合成能力及抗病蟲能力轉(zhuǎn)移到黃瓜上，黃瓜的抗病蟲防衛(wèi)能力將有可能增強(qiáng)。為此，筆者通過植物外源遺傳物質(zhì)動(dòng)態(tài)導(dǎo)入法［9］，選取絞股藍(lán)染色體作為供體，黃瓜原生質(zhì)體作為受體，采用電擊法將絞股藍(lán)染色體轉(zhuǎn)至黃瓜原生質(zhì)體細(xì)胞中，研究了其調(diào)控黃瓜次生代謝產(chǎn)物的作用，以期為黃瓜育種工作提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 供試植物。絞股藍(lán)種子購自安康平利縣百草堂科技有限公司絞股藍(lán)種質(zhì)資源圃基地;黃瓜品種“津研4號(hào)”由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。

1．1．2 試劑。甘露醇(天津市福晨化學(xué)試劑廠)、纖維素酶(Onozuka R-10，日本 Yakult公司)、果膠酶(Macerozyme R-10，日本 Yakult公司)。

1．1．3 儀器。HZS-H水浴振蕩器;UV-2100型紫外可見分光光度計(jì);GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī);TGL-16G臺(tái)式離心機(jī);恒壓、恒流DF-D電泳儀;UV-ⅥA型紫外透射反射儀;Shimadzu LC2010HT高效液相色譜儀、LCsolution色譜工作站(日本島津公司);多功能細(xì)胞電穿孔儀。

1．2 方法

1．2．1 絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及莖段染色體片段的分離制備［10－11］。取絞股藍(lán)無菌苗的葉片和莖段為外植體，切成0．5 cm小段培養(yǎng)在1．0 mg/L 6-BA+1．0 mg/L NAA組合的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織常規(guī)誘導(dǎo)，選擇最佳的激素配比進(jìn)行愈傷組織的增殖培養(yǎng)，調(diào)控6-BA和NAA的濃度將增殖培養(yǎng)的愈傷組織繼代培養(yǎng)成胚性愈傷組織。將胚性愈傷組織接種液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，獲得絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞。

取相對(duì)飽滿的懸浮細(xì)胞用質(zhì)量百分比為0．1%的秋水仙素處理16 h，用MS培養(yǎng)基洗滌后稱10 g放入100 ml裂解液中，解離絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜10 h;采用蔗糖密度梯度離心對(duì)懸浮細(xì)胞細(xì)胞核純化，過濾，1 500×g離心濃縮細(xì)胞核，低溫保存;將收集到的細(xì)胞核用75 mmol/L氯化鉀4℃低滲10 min，1 000 r/min離心10 min，沉淀懸于0．75 mol/L 1，6-己二醇的CPW緩沖溶液上37℃水浴10 min，再用7號(hào)針頭10 ml注射器推擠。將染色體溶液置于25%蔗糖溶液中，500×g離心60 min，大量染色體都集中在25%蔗糖界面上。

1．2．2 黃瓜原生質(zhì)的制備與純化。選取植株頂端未充分展開的幼嫩子葉，用清水沖洗干凈，75%乙醇浸泡數(shù)秒，再用0．1%HgCl2溶液消毒7 min，然后用無菌水清洗4～5次，撕下葉片下表皮，并將去掉下表皮一面置于盛有酶液培養(yǎng)皿中，在黑暗條件下25℃恒溫?fù)u床上50 r/min振蕩，以分離原生質(zhì)體。

1．2．3 絞股藍(lán)染色體片段轉(zhuǎn)染黃瓜原生質(zhì)體。受體:黃瓜原生質(zhì)體。DNA供體:分離純化的染色體。采用多功能細(xì)胞電穿孔儀器。使用參數(shù):脈沖電壓100～500 V，脈沖時(shí)間20～100 μs，脈沖寬度20 ～60 μs，脈沖次數(shù)1 ～5。電轉(zhuǎn)染緩沖液:0．5 mol/L 蔗糖、10 mmol/L CaCl2，10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4(pH 6．0)和0．03% 葡聚糖硫酸鉀。用轉(zhuǎn)染緩沖液調(diào)整原生質(zhì)體或細(xì)胞核濃度至1×107～5×107個(gè)/ml，取0．8 ml于每個(gè) Eppendorf管中，加入10～50 μg供體染色體，混勻，置冰上10 min。然后將原生質(zhì)體－染色體懸液轉(zhuǎn)入電擊小室，迅速放入電融合儀進(jìn)行脈沖電擊，將轉(zhuǎn)染后收集原生質(zhì)體進(jìn)行看護(hù)培養(yǎng)。

1．2．4 轉(zhuǎn)染子的培養(yǎng)與再生愈傷組織的誘導(dǎo)。以平皿固體培養(yǎng)基上生長旺盛的黃瓜愈傷細(xì)胞為看護(hù)者，其上覆蓋2張中速濾紙，將轉(zhuǎn)染子與融合子置于其上培養(yǎng)。經(jīng)過篩選培養(yǎng)條件:黑暗，(25±1)℃，空氣相對(duì)濕度為60% ～70%。培養(yǎng)基為KM8P添加0．5 mol/L甘露醇、30 g/L葡萄糖、0．03%葡聚糖硫酸鉀、0．5 mg/L 2，4-D 和 1．0 mg/L 6-BA。培養(yǎng) 15 ～30 d后，2，4-D減半，甘露醇減半，調(diào)控不同的激素濃度誘導(dǎo)出再生愈傷組織。

1．2．5 再生愈傷組織中總黃酮和人參皂苷Rb1檢測(cè)。采用分光光度法，以蘆丁對(duì)照品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，于510 nm波長下比色定量測(cè)定再生愈傷組織中總黃酮吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得蘆丁濃度(Y)與吸光度(A)的關(guān)系曲線的回歸方程:Y=0．101 7A－0．001 6。相關(guān)系數(shù) r=0．998 2，蘆丁濃度與吸光度有良好的相關(guān)性。

采用HPLC法，以流動(dòng)相為乙腈(a)－水(b)梯度洗脫(0～10 min，15%a→20%a;10 ～40 min，20%a→40%a;40 ～60 min，40%a～15%a)，流速為1 ml/min，檢測(cè)波長為203 nm，柱溫30℃的條件對(duì)標(biāo)品和各樣品進(jìn)行梯度洗脫，測(cè)其再生愈傷組織人參皂苷Rb1的含量。

2 結(jié)果與分析

2．1 絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及染色體的分離 在優(yōu)化的培養(yǎng)基上對(duì)絞股藍(lán)愈傷組織進(jìn)行細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可不斷增殖，狀態(tài)良好。其胚性愈傷組織培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞見圖1。將絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞預(yù)處理和酶解去除細(xì)胞壁細(xì)胞膜，經(jīng)抽濾、自然沉降、離心等方法得到絞股藍(lán)染色體(圖2)。

2．2 黃瓜原生質(zhì)體的制備分離與純化 圖3是由懸浮培養(yǎng)的“津研4號(hào)”黃瓜胚性細(xì)胞經(jīng)酶解制備的原生質(zhì)體，原生質(zhì)體的產(chǎn)率和完整率都較高，獲得了高質(zhì)量的原生質(zhì)體，建立了黃瓜原生質(zhì)體的制備和培養(yǎng)等方法。

圖1 絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞

圖2 絞股藍(lán)染色體

2．3 轉(zhuǎn)染子的培養(yǎng)與再生愈傷組織的誘導(dǎo) 轉(zhuǎn)染后的原生質(zhì)體培養(yǎng)采用的是固體薄層培養(yǎng)法，將3～4 ml的原生質(zhì)體按照一定細(xì)胞密度(1×104～1×105個(gè)/L)與等體積的處于45℃的瓊脂培養(yǎng)基混合，在培養(yǎng)皿中制成薄層固體平板，在含0．5 mg/L 2，4-D、1．0 mg/L 6-BA 的MS 固體培養(yǎng)基上長成結(jié)構(gòu)致密的帶綠點(diǎn)大塊愈傷組織(圖4)。

圖3 純化的原生質(zhì)體

2．4 愈傷組織中黃酮化合物含量的測(cè)定 由表1可知，侵染絞股藍(lán)DNA的再生黃瓜愈傷組織中總黃酮含量高于對(duì)照組，其再生愈傷組織總黃酮含量高達(dá)1．248%，比對(duì)照組高出4．38%，也明顯高于蔡健等測(cè)得的含量［12］。

2．5 再生愈傷組織人參皂苷Rb1含量的測(cè)定 測(cè)定結(jié)果表明，侵染絞股藍(lán)黃瓜愈傷組織中含有絞股藍(lán)人參皂苷Rb1達(dá)(0．92 ±0．07)mg/g，雖然含量很低，但可以說明絞股藍(lán)中某些成分對(duì)黃瓜的次級(jí)代謝產(chǎn)物起了一定的作用，具體如何調(diào)控還有待于進(jìn)一步研究。

圖4 再生愈傷組織

表1 愈傷組織中黃酮化合物含量的比較

圖5 絞股藍(lán)皂苷Rb1標(biāo)品色譜

圖6 轉(zhuǎn)染組愈傷組織樣品色譜

轉(zhuǎn)染組愈傷組織樣品液相色譜分離情況按“1．2．5”色譜條件測(cè)定，比較人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品及轉(zhuǎn)染組色譜(圖5、6)，可以看出在該試驗(yàn)條件下色譜峰分離良好。在保留時(shí)間為11．198 min時(shí)出現(xiàn)人參皂苷Rb1的峰值，是否存在其他皂苷還有待于進(jìn)一步研究。

2．5．1 線性關(guān)系的考察。分別取絞股藍(lán)皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品5、10、15、20 和 25 μl進(jìn)樣，在相同條件下測(cè)定，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸曲線性方程:y=324 161x－244 034，r=0．999 8，表明進(jìn)樣量在 0．5 ～2．5 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．5．2 精密度試驗(yàn)。量取對(duì)照溶液，按“1．2．5”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1．02%。

2．5．3 重現(xiàn)性試驗(yàn)。取供試品1份，按供試品溶液制備方法平行制備5份并測(cè)定。測(cè)定含量的RSD為2．18%，表明重現(xiàn)性較好。

2．5．4 回收率試驗(yàn)。取同一樣品6份，分別加入人參皂苷Rb1對(duì)照品2 mg，按照供試品溶液制備方法，進(jìn)樣10 μl，測(cè)定含量，計(jì)算平均回收率為98．20%，RSD為2．20%。

2．5．5 含量測(cè)定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組愈傷組織人參皂苷Rb1含量為 1．04 mg/g。

3 討論

外源DNA導(dǎo)入一些物種可以達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的，其可靠性和可行性已經(jīng)在水稻、野生大豆外源DNA導(dǎo)入研究中得到驗(yàn)證［13－15］。而絞股藍(lán)和黃瓜同屬葫蘆科植物，在次生代謝的調(diào)節(jié)上有很多共同之處，它們的甲羥戊酸途徑是比較活躍的，能夠較好地合成距離人參皂苷非常近的前體物2，3-氧化鯊烯［16］。然而絞股藍(lán)在黃酮和皂苷上的代謝上要遠(yuǎn)比黃瓜活躍。

該研究將絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞預(yù)處理和酶解去除細(xì)胞壁細(xì)胞膜，經(jīng)抽濾、自然沉降、離心等方法得到絞股藍(lán)染色體，為絞股藍(lán)染色體轉(zhuǎn)染黃瓜原生質(zhì)體提供了較好的受體。試驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮含量高于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組愈傷組織中黃酮含量比對(duì)照組高出4．38%。而且在轉(zhuǎn)染組還含有人參皂苷Rb1，雖然含量較低，但可以說明絞股藍(lán)種皂苷成分可能對(duì)黃瓜的次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)控起了一定的作用，可能就是甲羥戊酸途徑中距離人參皂苷非常近的前體物——2，3-氧化鯊烯所調(diào)控，具體的調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

該研究采用電轉(zhuǎn)染試圖將絞股藍(lán)染色體轉(zhuǎn)染至黃瓜原生質(zhì)體，并經(jīng)過經(jīng)看護(hù)培養(yǎng)誘導(dǎo)出再生愈傷組織，經(jīng)分光光度檢測(cè)轉(zhuǎn)染組黃酮含量比對(duì)照組高，尤其是再生黃瓜愈傷組織中檢測(cè)到絞股藍(lán)人參皂苷Rb1。利用該項(xiàng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)作物科間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移在一定條件下是可能的，同時(shí)為黃瓜的種質(zhì)資源創(chuàng)新及育種提供了理論與技術(shù)依據(jù)。

［1］吳雪霞，查丁石，楊少軍．我國黃瓜育種研究進(jìn)展［J］．江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010(9):53－55．

［2］武濤，秦智偉，周秀艷，等．轉(zhuǎn)基因技術(shù)在黃瓜性狀改良中的應(yīng)用及戰(zhàn)．略思考［J］．中國蔬菜，2010(20):1－8．

［3］AUGUSTIIN J M，KUZINA V，ANDERSEN S B，et al．Molecular activities，biosynthesis and evolution of triterpenoid saponins［J］．Phytochemistry，2011，72(6):435 －457．

［4］MAKOI J H J R，CHIMPHANGO S B M，DAKORA F D．Seed flavonoids and anthocyanins as markers of enhanced plant defence in nodulated cowpea(Vigna unguiculata L．Walp．)［J］．Field Crops Research，2010，118(1):21 －27．

［5］TI X，ZHANG Q．Advances in research of induced resistance to insects in cotton［J］．Frontiers of Biology in China．2009，4(3):289 －297．

［6］何顯忠，邱江沁．絞股藍(lán)化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］．中國中醫(yī)藥信息雜，2008，5(S1):84．

［7］李金青，楊洪軍．絞股藍(lán)的藥理作用研究進(jìn)展［J］．中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3(7):189．

［8］KAO T H，HUANG S C，INBARAJ B S．Determination of flavonoids and saponins in Gynostemma pentaphyllum(Thunb．)Makino by liquid chromatography-mass spectrometry［J］．Analytica Chimica Acta，2008，626(2):200－211．

［9］朱培坤．高等植物染色體雜交［M］．濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社，2011．

［10］葉金山，溫強(qiáng)，江香梅，等．殼斗科5屬植物基因組DNA提取方法研究［J］．江西林業(yè)科技，2008(6):10 －12．

［11］鞏艷紅．劉軍．張健，等．毛豹皮樟的葉片DNA提取及其RAPD引物篩選［J］．西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，19(4):35 －37．

［12］蔡健，王薇．黃瓜葉中總黃酮含量的研究［J］．食品科學(xué)，2005，26(8):194－497．

［13］羅忠訓(xùn)，萬樹青，夏桂先，等．未傳粉子房顯微注射向水稻轉(zhuǎn)移外源基因的研究［J］．科學(xué)通報(bào)，1987，32(11):863 －865．

［14］CHRISTOU P．Production of transgene rice plant from agrinomically important inlica and japonica via electric discharge partical acceleration of exogenous DNA into immature zygoyic embryos［J］．Bio/Technology，1991，9:91 －96．

［15］雷勃鈞，尹光初，盧翠華，等．外源DNA直接導(dǎo)入大豆的研究［J］．大豆科學(xué)，1991，10(10):58 －63．

［16］郜玉鋼，王亞星，臧埔，等．人參皂苷生物合成途徑的初步研究［J］．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011(10):2422－2423．