梁昊岳，楊晚竹，程雪蓮，王金宏

流式細胞術(shù)操作軟件在小鼠造血干細胞檢測中的應(yīng)用比較

梁昊岳，楊晚竹，程雪蓮，王金宏

目的：探討流式細胞術(shù)中不同分析軟件在小鼠造血干細胞分析中的特點和差異。方法：使用小鼠骨髓細胞懸液作為實驗材料，在BD AriaIII和BD Influx流式細胞儀上檢測小鼠造血干細胞，分別應(yīng)用FACSDiva、FACSSortware軟件對檢測數(shù)據(jù)進行分析，并比較分析結(jié)果。結(jié)果：FACSDiva和FACSSortware軟件在參數(shù)調(diào)節(jié)、補償調(diào)節(jié)、圈門、數(shù)據(jù)保存和分選設(shè)置方面存在細微差異，均可以實現(xiàn)多色流式分析和高速流式分選。結(jié)論：FACSDiva和FACSSortware軟件分析同一樣本所得結(jié)果有較高的一致性，均是使用流式細胞儀不可或缺的工具。

流式細胞術(shù)；造血干細胞；FACSDiva軟件；FACSSortware軟件

0 引言

造血系統(tǒng)的細胞發(fā)生于骨髓中的一群具有自我更新能力的細胞，即造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）[1]。造血干細胞移植是惡性血液疾病的一種重要治療手段，在科學(xué)研究中常利用動物模型模擬人體的生理條件來考察造血干細胞移植效果，流式細胞術(shù)在臨床和科研監(jiān)測移植效果中都發(fā)揮著重要的作用。目前關(guān)于檢測小鼠骨髓造血干細胞表型的方法有LSK、SLAM、SP等。Osawa等利用CD34-/lowckit+Sca-1+Lin-組合檢測小鼠HSC是比較常用的方法。SLAM家族的某些分子，其配體CD150和CD48也是分離小鼠HSC的標志。CD48-CD150+是高度富集的造血干細胞/祖細胞的標志[2-6]。Goodell等定義具有外排染料Hoechst33342的細胞為側(cè)群細胞（SP細胞），用來篩選小鼠HSC[7-9]。

應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測小鼠骨髓造血干細胞，其結(jié)果不僅受樣品固有性質(zhì)、樣品的處理方法和熒光染色的影響，還受流式操作軟件的影響。在實際工作中，美國BD公司的BD Aria和BD Influx分別是應(yīng)用最多和最高端的流式細胞儀，其相應(yīng)的進行流式分析和分選操作的專業(yè)軟件分別為FACSDiva和FACSSortware，但是目前對上述2款軟件使用操作方法的比較尚無報道。該研究旨在對不同流式操作軟件的使用方法進行比較，并對應(yīng)用不同軟件檢測小鼠骨髓造血干細胞的分析結(jié)果進行比較，希望能對流式操作軟件的使用有一定借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

BD AriaIII流式細胞儀，BD Influx流式細胞儀，Accudrop Beads（美國Becton Dickinson公司），Rainbow Beads（美國Becton Dickinson公司），APC-Cy7標記的抗小鼠Lineage抗體，APC標記的抗小鼠ckit抗體，F(xiàn)ITC標記的抗小鼠CD34抗體，PE-Cy7標記的抗小鼠Sca-1抗體，PerCP標記的抗小鼠CD150抗體，PE標記的抗小鼠CD41抗體，1×PBS鞘液，磷酸緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

將Rainbow Beads和Accudrop Beads用無菌鞘液稀釋備用，取小鼠骨髓細胞，使用流式抗體染色，避光30min后，用2mL磷酸緩沖液洗滌細胞，離心后重懸于PBS溶液，溶液中細胞濃度控制在107個/mL以下，2 h內(nèi)上機進行流式分析。

1.2.2 樣品檢測

開啟BD AriaIII流式細胞儀，用Rainbow Beads檢測儀器各通道，應(yīng)用FACSDiva檢測軟件。在前向角散射光/側(cè)向角散射光（FSC/SSC）散點圖中顯示細胞群，利用DAPI染料除去死細胞，調(diào)節(jié)熒光電壓等參數(shù)，記錄總細胞數(shù)不少于200 000個。開啟BD Influx流式細胞儀，用Rainbow Beads調(diào)節(jié)光路，檢測儀器各通道，應(yīng)用FACSSortware檢測軟件。相同方法調(diào)節(jié)參數(shù)，記錄總細胞數(shù)不少于200 000個。

1.2.3 小鼠骨髓造血干細胞流式分析

分別應(yīng)用FACSDiva和FACSSortware檢測軟件，對小鼠骨髓造血干細胞進行流式分析，圈選表型為Lin-CD34-c-kit+sca-1+CD150+CD41-的小鼠骨髓造血干細胞，分析細胞群比例。

2 結(jié)果

2.1 FACSDiva和FACSSortware軟件總觀

FACSDiva軟件總觀主要由數(shù)據(jù)獲取、參數(shù)調(diào)節(jié)、流式圖顯示、補償調(diào)節(jié)、液流顯示、流式分選、數(shù)據(jù)保存等幾個模塊組成。FACSSortware軟件總觀主要由數(shù)據(jù)獲取、參數(shù)調(diào)節(jié)、流式圖顯示、補償調(diào)節(jié)、流式分選、數(shù)據(jù)保存等幾個模塊組成。2款軟件都可以完成多激光、多色的流式分析和高速流式分選，二者在總觀方面有如下區(qū)別：

（1）FACSDiva軟件可全屏顯示于2臺計算機顯示器，操作較為方便，顯示空間較大，各模塊顯示可不重疊；FACSSortware軟件只能顯示于單臺計算機顯示器，顯示空間較小，各模塊顯示可能會有重疊，但節(jié)省成本和空間。

（2）FACSDiva軟件中有流式細胞儀液流情況界面，顯示為“70 micron”2個模塊；FACSSort-ware軟件中沒有這2個模塊，而是將它們分別單獨顯示于計算機顯示器上方的Drop顯示屏和Stream顯示屏。

2.2 FACSDiva和FACSSortware數(shù)據(jù)獲取模塊

FACSDiva和FACSSortware軟件數(shù)據(jù)獲取模塊包括數(shù)據(jù)獲取、記錄、刷新、記錄時間和細胞個數(shù)的“Acquire”、“Record”、“Restart/Reset”、“ElapsedTime”、“Rate”選項，二者主要區(qū)別如下：

（1）FACSDiva軟件數(shù)據(jù)獲取模塊包含設(shè)置收集數(shù)據(jù)的“Stopping Gate”和“Storage Gate”；而 FACSSortware將這2個選項設(shè)置在數(shù)據(jù)保存模塊中。

（2）FACSDiva軟件數(shù)據(jù)獲取模塊包含上樣和調(diào)節(jié)流速的“Load”和“Flow Rate”選項；FACSSortware中沒有上述2個選項，上樣和調(diào)節(jié)流速的按鍵和旋鈕被設(shè)置在機器上，這種設(shè)置適合于FACSSortware的單屏幕顯示方式，將軟件的部分功能安排在機器中，節(jié)約軟件顯示所需的空間。

2.3 FACSDiva和FACSSortware參數(shù)調(diào)節(jié)模塊

FACSDiva和FACSSortware軟件參數(shù)調(diào)節(jié)模塊都包括各激光流式通道顯示、電壓調(diào)節(jié)、線性/對數(shù)方式選擇等選項，二者差別如下：

（1）FACSDiva可以在軟件中刪除不需要的參數(shù)；FACSSortware不能刪除。

（2）FACSSortware可以在參數(shù)調(diào)節(jié)模塊中為各個通道添加標注，以表示這一熒光素連接的抗體；而FACSDiva需要在另外的“Experiment Layout”界面下實現(xiàn)這一功能。

2.4 FACSDiva和FACSSortware補償調(diào)節(jié)模塊

FACSDiva和FACSSortware軟件補償調(diào)節(jié)模塊都包括補償調(diào)節(jié)的基本功能，二者差別如下：

（1）作為分析軟件，F(xiàn)ACSDiva只需勾選“Enable Compensation”即可時刻觀察調(diào)節(jié)補償后的流式圖形變化，而FACSSortware有時則需要在每次調(diào)節(jié)補償后手動點擊“Visualize”才能觀察到流式圖形的變化，這是FACSSortware軟件的一個小的不便之處。

（2）不同樣本的補償顯示方面，F(xiàn)ACSDiva只需在數(shù)據(jù)獲取模塊選擇“Next Tube”，補償數(shù)據(jù)會自動顯示，而FACSSortware則需依次改變每個流式圖顯示的樣本數(shù)據(jù)，并在補償調(diào)節(jié)模塊中的“Data Source”選擇相應(yīng)的樣本，才能顯示不同樣本的補償。

2.5 FACSDiva和FACSSortware圈門顯示方式

2款軟件都可逐級圈門，并在等級圖中顯示。二者的區(qū)別在于：使用FACSDiva軟件圈選子門時需在流式圖中點擊右鍵“Show Populations”選擇顯示上一級門，再在上一級門的基礎(chǔ)上圈選子門；使用FACSSortware軟件圈選子門時需要首先點擊圖標，使流式圖顯示上一級門，再用鼠標左鍵單擊上一級門圖標，才可以實現(xiàn)圈選子門。若未用鼠標左鍵單擊上一級門圖標，則圈選出的子門在等級圖中顯示為上一級門的平行門。從圈門的角度分析，F(xiàn)ACSDiva軟件更為便捷。

2.6 FACSDiva和FACSSortware數(shù)據(jù)保存模塊

2款軟件都可以實現(xiàn)流式數(shù)據(jù)的按要求保存。二者的區(qū)別在于：FACSDiva軟件需要在獲取數(shù)據(jù)后手動將數(shù)據(jù)存儲到目的文件夾中；FACSSortware軟件可將數(shù)據(jù)的獲取和存儲同時進行，節(jié)省了操作時間。FACSSortware軟件中“FCS File”選項下顯示的即為存儲路徑和文件名，用戶可以自行選擇。

2.7 FACSDiva和FACSSortware流式管分選模塊

FACSDiva和FACSSortware軟件流式管分選模塊都可實現(xiàn)高速二路分選和四路分選，并可在軟件中選擇分選模式，單細胞分選都可選擇“Single Cell”模式。同時，軟件可以設(shè)置連續(xù)分選和固定細胞個數(shù)分選，并能進行Accudrop調(diào)節(jié)等[10]。二者的區(qū)別在于：

（1）FACSSortware軟件能夠自動避免各路分選細胞的重疊所造成的邏輯錯誤；FACSDiva軟件需要操作者自行判斷分選設(shè)置的門是否存在邏輯錯誤。

（2）FACSSortware軟件通過設(shè)置每路分選都有控制開始和停止的選項，可以實現(xiàn)在多路同時分選過程中停止單一路的分選；FACSDiva軟件只能統(tǒng)一開始和停止分選。

2.8 FACSDiva和FACSSortware 96孔板分選模塊

2款軟件都可以實現(xiàn)96孔板分選等微孔板分選和單細胞分選。二者的區(qū)別在于：

（1）FACSDiva軟件在單擊“Sort”開始分選時，微孔板會自動移動到設(shè)置好的分選位置；FACSSort軟件需要先單擊“Sort Ready”，將微孔板移動到設(shè)定的位置。

（2）FACSSort需要用鼠標將微孔板中需要分選的區(qū)域選中，使陰影覆蓋這一區(qū)域，才可以順利分選，否則陰影未覆蓋的區(qū)域不能進行分選；FACSDiva軟件無需這項操作，一經(jīng)開始即可連續(xù)分選。

2.9 FACSDiva和FACSSortware微孔板位置設(shè)置模塊

2款軟件都可以進行微孔板位置調(diào)節(jié)，通過上下左右箭頭設(shè)置微孔板位置，并單擊“Set Home”確定位置。二者的區(qū)別在于：FACSSortware軟件可以通過數(shù)字設(shè)定微孔板橫縱坐標的位置，這種設(shè)置更為精細；FACSDiva軟件只能通過大格或小格的移動調(diào)節(jié)微孔板位置，無數(shù)字化設(shè)置。

2.10 應(yīng)用FACSDiva和FACS Sortware軟件分析小鼠骨髓造血干細胞流式結(jié)果

圖1（a）和圖1（b）分別為FACSDiva和FACSSortware軟件分析小鼠骨髓造血干細胞流式結(jié)果。P6門內(nèi)為小鼠骨髓造血干細胞，其表型為Lin-CD34-c-kit+sca-1+-CD150+CD41-。FACSDiva和FACSSortware軟件分析小鼠骨髓造血干細胞群比例分別為 17.3%和17.9%，分析結(jié)果具有較高的一致性。

圖1 應(yīng)用FACSDiva和FACSSortware分析小鼠骨髓造血干細胞流式結(jié)果

3 討論

近年來，流式細胞儀在血液學(xué)，特別是血液病診斷方面有著較為廣泛的應(yīng)用[11-12]，流式軟件的功能也更加強大，在分析細胞周期、細胞凋亡等方面發(fā)揮著重要的作用[13-14]。2003年，BD推出了第一臺FACSAria分析分選型流式細胞儀。后經(jīng)多次更新?lián)Q代，目前主要使用的為BD FACSAriaⅢ。BD FACSDiva軟件是BD LSR系列、BD Canto系列、BD Aria系列流式細胞儀通用的流式操作軟件，能有效地支配儀器、獲取及分析數(shù)據(jù)、完成質(zhì)控等。它可以將一個實驗方案由一個平臺移動到另一個平臺，給儀器的使用者和維護者提供了一個高效、便捷的工具，保證了數(shù)據(jù)的可靠性。BD Influx是當今最高端的、可與Beckman Moflo XDP相媲美的流式細胞分析分選儀。BD FACSSortware軟件提供對流式細胞儀的全面控制，從儀器設(shè)置到實驗獲取的補償調(diào)節(jié)、分析和分選，為操作者提供全方位的幫助。由于FACSSortware軟件為單個顯示器顯示，所以部分功能被設(shè)置在機器上，如上樣、調(diào)節(jié)流速、顯示液流狀態(tài)等。從使用角度分析，F(xiàn)ACSDiva在參數(shù)設(shè)置、補償調(diào)節(jié)和圈門方面更加方便，F(xiàn)ACSSortware軟件在數(shù)據(jù)存儲、自動糾正分選中的邏輯錯誤、開始和停止單一路分選、數(shù)字化調(diào)節(jié)微孔板位置等方面有更多的優(yōu)勢。

實驗中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ACSDiva軟件和FACSSortware軟件在使用過程中會出現(xiàn)與機器失去連接或死機的現(xiàn)象，影響軟件的正常使用。此外，使用FACSSortware軟件存在分選時有時不能顯示分選所得細胞數(shù)、使用96孔板分選時微孔板不能正確移動等問題，這些都有待進一步改進。同時，F(xiàn)ACSDiva軟件和FACSSortware軟件都應(yīng)增加上樣保護功能，即當樣本接近吸空時自動停止上樣，避免管路內(nèi)進入氣泡或液流斷開，影響后續(xù)使用。只有不斷改進軟件的設(shè)置和功能，提高軟件對使用者的友好度，軟件才能為更多使用者所接受和掌握，更好地發(fā)揮其應(yīng)有的作用。

綜上所述，該文分析和比較了兩款常用的流式細胞儀操作軟件和小鼠骨髓造血干細胞流式結(jié)果，為流式操作軟件的使用提供了借鑒。流式操作軟件是使用流式細胞儀不可或缺的工具，可以預(yù)見，在不久的將來，在FACSDiva和FACSSortware軟件的幫助下，BD Aria系列和BD Influx分析分選型流式細胞儀在臨床和科研領(lǐng)域的應(yīng)用范圍會更加廣闊、更為深入，不斷為人類認識疾病、治療疾病提供幫助和動力。

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（收稿：2014-10-06 修回：2014-12-30）

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Comparison of kinds of flow cytometry operation software in mice bone marrow hematopoietic stem cell analysis

LIANG Hao-yue,YANG Wan-zhu,CHENG Xue-lian,WANG Jin-hong
（State Key Laboratory of Experimental Hematology,Institute of Hematology&Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300020,China）

ObjectiveTo explore the characteristics and differences of kinds of flow cytometry operation software for mice bone marrow hematopoietic stem cell analysis.MethodsWith mice bone marrow cells as experimental materials,cells were stained by antibodies and measured by BD AriaIII and BD Influx flow cytometer.The results of hematopoietic stem cell were analyzed and compared by FACSDiva and FACSSortware software.ResultsDiscrepancies of FACSDiva and FACSSortware involved parameter regulation,compensation regulation,gating,data storage and sorting parameter setting. Both of the softwares were effective to complete multicolor flow analysis and high-speed cell sorting.ConclusionResults of the same sample analyzed by FACSDiva and FACSSortware can obtain high consistency.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（3）：5-8]

flow cytometry;hematopoietic stem cell;FACSDiva software;FACSSortware software

R318；TP316

A

1003-8868（2015）03-0005-04

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.03.005

國家自然科學(xué)基金資助項目（81001377）

梁昊岳（1987—），男，技師，主要從事流式細胞測試方面的工作，E-mail：yueyue_0612@aliyun.com。

300020天津，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所），實驗血液學(xué)國家重點實驗室（梁昊岳，楊晚竹，程雪蓮，王金宏）

王金宏，E-mail：jyuwang@sina.com