李天芝，于新友，沈志強(qiáng)，2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

豬肺炎支原體PCR快速檢測方法的建立和應(yīng)用

李天芝1，于新友1，沈志強(qiáng)1，2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

根據(jù)豬肺炎支原體P36基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，建立了豬肺炎支原體PCR診斷方法，該方法對(duì)豬肺炎支原體的擴(kuò)增結(jié)果為陽性，對(duì)照菌株擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，對(duì)豬肺炎支原體檢測的靈敏性為1 pg總DNA量。并用建立的PCR診斷方法檢測52份豬肺炎支原體疑似病料，檢出陽性病例18份，以上結(jié)果表明該P(yáng)CR方法特異性強(qiáng)敏感性高、簡便、快速，可用于豬肺炎支原體疾病的診斷。

豬肺炎支原體；PCR；診斷

豬肺炎支原體（Mhp）可引起豬支原體肺炎（MPS），該病又叫豬霉形體肺炎或豬氣喘病，是豬的一種高發(fā)性、慢性呼吸道傳染病，主要臨床表現(xiàn)為咳嗽和氣喘，一年四季均可發(fā)病，但以冬、春寒冷季節(jié)較常見，各種日齡豬均可發(fā)病，但死亡率低，病豬生長緩慢，飼料利用率低，給世界各國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。豬肺炎支原體傳統(tǒng)的檢測方法主要有病原分離[3]、核酸探針[4]、間接血凝試驗(yàn)[5]和ELISA[6]等方法這些方法有的操作繁瑣，診斷時(shí)間長，結(jié)果重復(fù)性不好，有的難以檢測出微量病毒，不適宜疾病早期診斷，本研究設(shè)計(jì)了針對(duì)豬肺炎支原體P36基因的引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，建立檢測了豬肺炎支原體的PCR檢測方法，并用該方法對(duì)所采集的病料進(jìn)行檢測分析。

1 材料與方法

1．1 菌種和病料

豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌2型、豬胸膜肺炎放線桿菌由本實(shí)驗(yàn)室分離、保存。病料采自山東省各地豬場臨床診斷為豬支原體肺炎的豬肺臟。

1．2 主要試劑及儀器

pMD18-T載 體、Premix Taq、DL2000 Marker購自寶生物工程（大連）有限公司，多功能DNA純化回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，PCR儀購自BIO-RAD公司。

1．3 引物設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank發(fā)表的Mhp P36（X67286） 基 因 序 列， 用Primer primer5．0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，P1：5'-G ATTAGTGTCTCCCGTTAT-3'，P2：5'- TCACCCATCACGTAGGCC -3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1．4 PCR模板制備

參照百泰克細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取豬肺炎支原體基因組DNA，并提取其他幾種細(xì)菌的DNA作為模板。

1．5 豬肺炎支原體P36基因的PCR擴(kuò)增及條件優(yōu)化

以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，對(duì)各擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，包括退火溫度(45～55 ℃梯度溫度，每2 ℃為1個(gè)梯度)、引物濃度(0．1～1．1 μmol/L，每0．2 μmol/ L為1個(gè)梯度)等，最終確定的擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入95 ℃30 s、51 ℃ 30 s、72 ℃30 min循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取5 μL產(chǎn)物，1．5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外成像。

1．6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定

首先取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL在1．5%的瓊脂糖凝膠上電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描進(jìn)行初步鑒定。然后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18-T克隆載體于4 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株DH5α。挑取單個(gè)的轉(zhuǎn)化菌落，加LB溶液培養(yǎng)18 h后用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA用PCR方法進(jìn)行鑒定，將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序鑒定。將測序結(jié)果與參照的豬肺炎支原體P36基因序列同源性比較。

1．7 特異性試驗(yàn)

分別提取豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌2型、豬胸膜肺炎放線桿菌的DNA，用已建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1．8 敏感性測定

豬肺炎支原體的基因組DNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的細(xì)菌基因組DNA使其分別相當(dāng)于含有100 ngDNA、10 ngDNA、1 ngDNA、100 pgDNA、10 pgDNA、1 pgDNA、0．1 pgDNA的含量，分別進(jìn)行PCR檢測，確定其敏感性。

1．9 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的PCR檢測方法，對(duì)豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌2型、豬胸膜肺炎放線桿菌DNA，重復(fù)檢測3次，以驗(yàn)證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1．10 臨床樣品的檢測

對(duì)52份豬肺炎支原體疑似病料，用本試驗(yàn)優(yōu)化建立的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物全部進(jìn)行測序鑒定，并利用生物學(xué)軟件BLAST進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1．5%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物在351 bp處可見特異性DNA擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小相符（圖1）。測序結(jié)果顯示擴(kuò)增的序列與參照的豬肺炎支原體P36基因（X67286）的同源性為100%。

2．2 特異性試驗(yàn)

利用所設(shè)計(jì)的引物及所確定的最佳反應(yīng)條件分別對(duì)豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌2型、豬胸膜肺炎放線桿菌的DNA進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果7菌株中只有豬肺炎支原體能擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，大小分351 bp(預(yù)期的為351 bp)，而其他均未擴(kuò)增出相應(yīng)的片段（圖2）。說明本研究建立的方法特異性好。

圖1 豬肺炎支原體擴(kuò)增結(jié)果

圖2 特異性試驗(yàn)

圖3 敏感性試驗(yàn)

2．3 敏感性試驗(yàn)

取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約351 bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符。從結(jié)果可以看出，該P(yáng)CR檢測靈敏度可以達(dá)到1 pgDNA（圖3）。

2．4 重復(fù)性試驗(yàn)

經(jīng)過3次重復(fù)操作，結(jié)果一致，說明建立的方法是穩(wěn)定、可靠的。

2．5 檢測方法的應(yīng)用

用本試驗(yàn)優(yōu)化建立的PCR方法對(duì)52份豬肺炎支原體疑似病料進(jìn)行檢測，4 h內(nèi)可出結(jié)果，檢出陽性病例18份，陽性率為34．6%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)參照Genbank中豬肺炎支原體P36基因序列，在其高度保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立了豬肺炎支原體PCR診斷方法。通過對(duì)豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌2型、豬胸膜肺炎放線桿菌的擴(kuò)增表明，本試驗(yàn)所建立的PCR檢測方法特異性高，敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該P(yáng)CR檢測豬肺炎支原體靈敏度可以達(dá)到1 pgDNA。

國內(nèi)外有關(guān)豬肺炎支原體臨床病例方面的報(bào)道較多，而病原菌檢測方法的報(bào)道卻很少。由于該病傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測方法(病原分離與生化鑒定等)繁雜費(fèi)時(shí)，且檢出率較低。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件建立的豬肺炎支原體PCR檢測方法，直接從病料提取細(xì)菌DNA，不需要進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即可判斷是否患有豬肺炎支原體感染，該方法具有檢測速度快、特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)52份臨床疑似病料進(jìn)行檢測，4 h內(nèi)可出結(jié)果，檢出陽性病例18份，檢出率為34．6%；用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測方法耗時(shí)數(shù)天，說明PCR方法較傳統(tǒng)方法有檢測速度快，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，能對(duì)該病進(jìn)行有效診斷。本試驗(yàn)建立的豬肺炎支原體PCR檢測方法可用于該病的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查。

[1] 辛彩云，譯．國際防制豬支原體肺炎會(huì)議報(bào)告簡介[J]．國外畜牧科技，2001，28(3)：45．

[2] 沈青春，寧宜寶，覃青松．豬肺炎支原體的研究進(jìn)展[J]．中國獸藥雜志，2003，37(6)：26-30．

[3] 孔令增，劉艷芬，劉鈾．廣東豬肺炎支原體的分離與鑒定[J]．中國獸醫(yī)科學(xué)，2013，43(10)：1016-1020．

[4] 李桂蘭，張映，邵國青．豬肺炎支原體斑點(diǎn)雜交檢測方法的建立及應(yīng)用[J]山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，32(6)：536-539．

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2015-08-07）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-06-011-14)

李天芝(1985-)，女，漢族，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷技術(shù)研究。