董海鷹 王知非?

人重組內(nèi)皮抑素聯(lián)合化療對人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤作用觀察

董海鷹 王知非?

目的 研究人重組內(nèi)皮抑素（內(nèi)皮抑素）對人肝癌單獨及聯(lián)合化療的作用。方法 應(yīng)用內(nèi)皮抑素或者聯(lián)合氟尿嘧啶（5-Fu）作用于Hepg-2肝癌裸小鼠移植瘤，在體外用cck-8檢測及流式細胞技術(shù)研究內(nèi)皮抑素對HepG-2作用，體內(nèi)實驗組移植瘤小鼠隨機分成A、B、C、D四組，每組5只。A組為陰性對照組，B組為單獨內(nèi)皮抑素治療組，C組為內(nèi)皮抑素聯(lián)合5-Fu化療組，D組為單獨5-Fu化療組。測量腫瘤體積1次/3d，給藥7d后比較各組抑瘤率，腫瘤病理HE染色，免疫組化檢測微血管計數(shù)（MVD）及VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）表達情況。結(jié)果 cck-8檢驗結(jié)果顯示藥物作用24h，單獨內(nèi)皮抑素僅在100μg/ml的劑量時對HepG-2細胞在體外有輕度殺傷作用，細胞死亡率20.7%，其余濃度無明顯殺傷作用；作用48h，內(nèi)皮抑素在50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml對HepG-2有一定殺傷作用，細胞死亡率分別為20.8%，46.3%，15.8%；在各時間段和濃度的內(nèi)皮抑素對HepG-2殺傷作用顯著小于相應(yīng)內(nèi)皮抑素+5-Fu組（P＜0.05）；流式細胞技術(shù)檢驗100μg/ml濃度內(nèi)皮抑素誘導(dǎo)HepG-2凋亡的作用，結(jié)果顯示內(nèi)皮抑素100μg/ml作用于HepG-2細胞24h及48h，細胞凋亡率分別為26.4%、21.1%（對照組為5.1%）；內(nèi)皮抑素100μg/ml在48h對人臍靜脈內(nèi)皮細胞有誘導(dǎo)凋亡作用，凋亡率為19.5%（對照組為11.7%）。聯(lián)合內(nèi)皮抑素和5-Fu化療，對于人肝癌HepG-2細胞裸鼠移植瘤抑瘤率高于單獨內(nèi)皮抑素和單獨5-Fu化療（P＜0.05）。結(jié)論 內(nèi)皮抑素對人肝癌HepG-2細胞有一定的殺傷作用，但并非在所有濃度和作用時段，對人肝癌HepG-2細胞及臍靜脈內(nèi)皮細胞有凋亡誘導(dǎo)作用，聯(lián)合內(nèi)皮抑素和5-Fu化療對于人肝癌HepG-2細胞裸鼠移植瘤抑瘤率顯著高于單獨內(nèi)皮抑素和單獨5-Fu化療，兩種藥物有協(xié)同作用。單獨內(nèi)皮抑素治療對于人肝癌HepG-2細胞裸鼠移植瘤有一定抑瘤作用，內(nèi)皮抑素可以減少HepG-2人肝癌裸鼠皮下移植瘤腫瘤微血管密度及VEGF表達。

內(nèi)皮抑素 HepG-2 異位移植瘤模型 抗血管生成

腫瘤抗血管生成目前已經(jīng)成為抗腫瘤研究的熱點，包括較多新的理論出現(xiàn)，如腫瘤血管正常化窗口期等。人重組內(nèi)皮抑素（恩度）是抗腫瘤血管生成的新藥，已經(jīng)推薦為 NCCN 肺癌臨床實踐指南中國版非小細胞肺癌一線治療方案，對于其他腫瘤的治療也正在臨床和臨床前嘗試。但抗腫瘤血管治療藥物，在腫瘤血管正常化理論根據(jù)下，在臨床如何與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用，尚無特別的基于該理論的實踐。肝細胞癌屬于多血管實體瘤,其發(fā)生發(fā)展過程與腫瘤血管生成密切相關(guān)。本試驗擬通過在小鼠肝癌移植瘤模型上聯(lián)合應(yīng)用內(nèi)皮抑素及經(jīng)典化療藥物，觀察抗腫瘤效果，以揭示對于肝癌，抗血管內(nèi)皮生成治療如何和臨床常規(guī)化療藥物聯(lián)合或者協(xié)同作用。報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞系和實驗動物 細胞株：HEPG2人肝癌細胞株，本實驗室凍存。實驗動物：4周齡的Balb/c- nu/nu裸鼠，雄性26只，體重16～18g，平均17g。購于浙江省中醫(yī)院實驗動物中心。飼養(yǎng)于浙江大學(xué)加州國際納米技術(shù)研究院分子影像平臺，SPF級凈化馮氏獨立送風(fēng)隔離籠具籠盒內(nèi)。所有操作均在飼養(yǎng)室的AIRTEH超凈臺無菌條件下完成。

1.2 試劑 （1）DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，含 100IU /ml青霉素，100μg/ml鏈霉素。（2）胰酶消化液：購于華美生物工程公司，4℃儲存。（3）G418購于Clontech公司。（4）人重組內(nèi)皮抑素注射液（每支150mg/ml）：于-4℃保存，使用時加入生理鹽水稀釋或加入完全培養(yǎng)基至所需濃度。（5）單克隆抗體CD31：丹麥DAKO公司；VEGF抗體 ，購于NeoMarkers公司，免疫組化檢測試劑盒，購于DAKO公司。

1.3 體外實驗 （1） 選取對數(shù)期生長的HepG-2細胞，制備細胞懸液濃度5×107/ml。在接種超凈臺內(nèi)，裸鼠背部皮膚75%酒精消毒，接種腫瘤細胞0.2ml/只。接種后第7天，隨機分組：空白對照組（A組），生理鹽水0.5ml/d；內(nèi)皮抑素單獨治療組（B組），內(nèi)皮抑素1.5mg/（kg·d），加生理鹽水稀釋至0.25ml/只；內(nèi)皮抑素和5-Fu聯(lián)合治療組（C組），內(nèi)皮抑素1.5mg/（kg·d），加生理鹽水稀釋至0.25ml/只，同時給予5-Fu［（20mg/（kg·d）］，加生理鹽水稀釋至0.25ml/只，每次注射前將兩藥抽于同一注射器混勻；單獨5-Fu治療組（D組）［20mg/（kg·d）］，加生理鹽水稀釋至0.25ml/只。均為腹腔內(nèi)注射，1次/d，連續(xù)7d。每日觀察各組裸鼠的精神、飲食、活動、大小便等一般情況。用藥前后稱取體重。每日用游標卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的最大長度（a）、寬度（b） 和高度（c），腫瘤大?。ㄩL×寬），腫瘤體積計算公式V=W2×L/2，式中W為寬度，L為長度。末次給藥后24h將裸鼠最后一次活體成像后脫臼處死，解剖剝離盡量剝離其表面包膜，切除心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織，分別稱重（臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/裸小鼠質(zhì)量） ，肉眼觀察及病理組織學(xué)切片觀察臟器及腫瘤病理學(xué)變化，并稱瘤重，根據(jù)以下公式計算腫瘤抑制率: 腫瘤抑制率=（1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重） ×100%。剖開胸腔及腹腔在活體熒光成像儀下觀察有無臟器轉(zhuǎn)移。（2）將移植瘤組織及心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織常規(guī)迅速采用10%中性福爾馬林液固定、脫水、石蠟包埋，制備連續(xù)切片，組織病理包括腫瘤組織HE染色，免疫組化檢測微血管計數(shù)（MVD）、VEGF等表達情況。CD31標記腫瘤微血管內(nèi)皮細胞，MVD的測量采用Weidner法：每張切片在100倍視野下尋找血管高密度區(qū)，再在高倍光鏡下計數(shù)微血管數(shù)目，每一個染成棕黃色的可與周圍血管、腫瘤細胞和其它結(jié)締組織分開的內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇作為一個微血管，血管腔的有無不作為判斷血管的標準，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)亦作為一個血管計數(shù)，分別計數(shù)5個視野，取均數(shù)表示MVD。VEGF計分標準：按著色細胞染色強度計分為：細胞呈陰性染色，無陽性細胞為-；染色弱，陽性細胞呈淡黃色，陽性細胞＜25%為+；染色中等，陽性細胞呈棕黃色，陽性細胞25%～50%為++；染色強，陽性細胞呈棕褐色，陽性細胞＞50%為+++。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 各組裸鼠用藥前體重無差異，用藥后體重均有增加，治療結(jié)束后各組裸鼠體重變化無差異（P＞0.05）。給藥期間，B組裸鼠一般情況（包括精神、活動、進食等）同A組，C組和D組活動不如A組及B組，但是精神尚可，無明顯萎靡，對外界刺激反應(yīng)活躍，四肢無消瘦，未見出現(xiàn)腹瀉反應(yīng)，且裸鼠全部存活至實驗結(jié)束。

2.2 各組移植瘤移植瘤體積變化 見表1。

表1 各組不同時間腫瘤體積對比［cm3，（x±s）］

2.3 各組裸小鼠治療前后小鼠質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較 見表2。

表2 各組裸小鼠治療前后小鼠質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較［g，（x±s）］

2.4 移植瘤大體觀察 腫瘤多為圓形或橢圓形，呈分葉狀，表面有結(jié)節(jié)突起，腫瘤與周圍肌肉及皮膚有粘連，呈淡紅色，質(zhì)脆，有的中心部分壞死。

2.5 病理切片HE染色光鏡下觀察 腫瘤細胞體積大，腫瘤細胞核深染，核大，常見有切跡、凹陷，核形不規(guī)則，核染色質(zhì)比例較大。瘤細胞或散在分布，或形成癌巢，成團分布。腫瘤周邊有較多淋巴細胞浸潤。符合腫瘤組織形態(tài)。

2.6 主要臟器變化 治療后各組裸小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟的臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。肉眼觀察，各組動物各臟器均無明顯異常。病理組織學(xué)切片觀察結(jié)果表明，各組均未出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變。

2.7 免疫組化檢查結(jié)果 （1）MVD：A:（15.2±3.1）［高倍視野顯微鏡（HPF）］; B:（6.7±1.3）（HPF）; C:（6.1±1.5）（HPF）; D:（12±2.3）（HPF）。與A組比較，B、C、D組MVD均顯著減少（P＜0.05）；C組和B組MVD均顯著少于D組（P＜0.05）；C組和B組MVD無顯著差別（P＞0.05）。（2）VEGF 檢測按著色細胞染色強度計分結(jié)果：A組:+++；B組: ++；C組:+-++；D組: ++。與A組比較，B、C、D組VEGF表達顯著減少（P＜0.05）；B、C、D組VEGF表達結(jié)果無明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

文獻報道靶向于VEGF的藥物可直接作用于異常表達VEGFR并部分依賴于VEGF生存的腫瘤細胞［1］，但內(nèi)皮抑素對于肝癌裸鼠移植瘤的治療選擇報道較少，因而參照其他文獻中［2，3］類似治療的劑量選擇1.5mg/（kg·d），另外結(jié)合動物實驗手冊，根據(jù)人和小鼠在用藥劑量上的比例系數(shù)（約0.11）結(jié)合本實驗給藥途徑得出該劑量。本實驗選擇5-Fu作為聯(lián)合治療用藥，因內(nèi)皮抑素聯(lián)合5-Fu具有協(xié)同作用，可以抑制大腸癌的肝轉(zhuǎn)移［4］，本實驗采取腹腔注射給藥方式［5］。但通過腹腔內(nèi)種植的滲透壓力泵持續(xù)腹腔注入內(nèi)皮抑素可以低于一次性注射5倍的劑量獲得更好的效果，進一步用人胰腺癌模型證實，該方法和腹腔注射1次/d比較，明顯提高腫瘤抑瘤率，可以小于后者8倍的劑量達到同樣抑瘤率 ，并且在兩個國家已經(jīng)開始臨床試驗［6］。但本實驗較大程度上是對實驗?zāi)Ｐ偷囊粋€嘗試性應(yīng)用，所以未選用該給藥方法。

本實驗中，C組和B組MVD均顯著少于D組；C組和B組MVD無顯著差別。說明雖然內(nèi)皮抑素聯(lián)合5-Fu能顯著提高抑瘤率，但是對于減少MVD未見明顯協(xié)同作用；內(nèi)皮抑素單獨應(yīng)用可明顯減少腫瘤MVD，與聯(lián)合5-Fu化療組無明顯差別，盡管單獨化療對減少MVD有一定作用。單獨給予5-Fu亦引起一定的MVD減少，但是C組的MVD與B組比較無顯著差異，而C組抑瘤率明顯高于B組，提示在相同的微血管密度減少情況下，結(jié)合化療會提高抑瘤率。另外相對于D組，C組MVD明顯減少，而且抑瘤率明顯提高，采用兩藥相互作用系數(shù)（CDI）評價兩藥相互作用性質(zhì)，聯(lián)合用藥組統(tǒng)計結(jié)果顯示，CDI=0.9261，說明內(nèi)皮抑素和5-Fu兩種藥物有協(xié)同作用，這種協(xié)同作用機制可通過抗腫瘤血管生成中腫瘤血管正常化理論解釋［7］，在此期間，腫瘤組織血流量暫時增大、血流分布更加均勻、合理，可增加化療藥物和細胞毒性藥物的傳遞效率，增進化學(xué)治療的效果；而隨之而來的血氧含量的增高可明顯提高腫瘤組織細胞對放療的敏感性。對于內(nèi)皮抑素是否亦和Avastin一樣可誘導(dǎo)腫瘤血管正?；?，目前文獻未見報道，理論上說，任何恢復(fù)促血管生成和抗血管生成分子平衡的治療均可誘導(dǎo)血管正?；?］，實際上，包括減少對激素依賴的腫瘤的激素水平因可降低VEGF的表達亦會導(dǎo)致血管正常化。但內(nèi)皮抑素和血管靶向藥物是否有此效果目前還未見報道［9］，因此本實驗結(jié)果顯示的協(xié)同作用可能與此有關(guān)。

治療后各組裸小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟的臟器系數(shù)無顯著性差異（ P＞ 0.05） 。肉眼觀察，各組動物各臟器均無明顯異常;病理組織學(xué)切片觀察結(jié)果表明，各組均未出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變。說明內(nèi)皮抑素及內(nèi)皮抑素聯(lián)合5-Fu治療對裸鼠主要臟器無明顯損害。在免疫組化方面，除檢測MVD外，還檢測了VEGF在治療后的表達，內(nèi)皮抑素可通過阻斷VEGF受體KDR/FIK一1酪氨酸的自磷酸化和一些蛋白激酶的激活［有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）］，阻斷VEGF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑 。內(nèi)皮抑素亦能通過下調(diào)腫瘤細胞VEGF mRNA及蛋白質(zhì)的表達而影響內(nèi)皮細胞上一氧化氮合成酶的活性，減少VEGF誘導(dǎo)的一氧化氮的生成，從而抑制了VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移和血管的形成 。VEGF在肝癌患者體內(nèi)呈過高表達，與肝癌的生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及治療密切相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示與A組比較，B、C、D組VEGF表達顯著減少（P＜0.05）；與內(nèi)皮抑素下調(diào)內(nèi)源性VEGF的表達有關(guān)。

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Objective To evaluate endostatine 's anti-tumor effects combined with chemothery using HCC HepG-2 tumor xenograft mouse model. Methods HepG-2 cells were transplanted subcutaneously to make a xenograft tumor model ，tumor's growth was observed in vivo. 20 mice of 4 weeks age was made into HepG-2 tumor model and were divided into 4 groups as group A，B，C，D ，A as control with normal sodium ，B with endostatine，C with endostatine combind with 5-Fu，D with 5-Fu，body weight and tumor size were measured every 3 days to observe the change of xenografted tumor. Results Endostatine had a cytoxic effect on HepG-2 cells at 24h（cell death rate 20.7%）with 100μg/ml concentration and 48h at 50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml concentration（cell death rate 20.8%，46.3%，15.8%）; at 100μg/ml ，endostatine induced apoptosis in HepG-2 after 24h and 48h，apoptosis rate was 19.5%（11.7% as control）. Endostatine had the highest tumor inhabit rate （TIF） when combined with 5-Fu chemothery compared with either endostatine alone or 5-Fu alone （P＞0.05），endostatine alone had a certain tumor inhibitoy effects when treating tumor alone . Microvessle density （MVD） and expression of VEGF were reduce after endostatine treatment either alone or combine with 5-Fu. Conclusions Endostatine has cytoxic effects on HepG-2 cells in vitro only at certain dose and time period ，it can induce apoptosis in both HepG-2 cells and human human umbilical vein cells . Combining with 5-Fu chemothery can have a synergistic effect on TIF compared with treating with any agent alone .Endostatine reduces tumor's MVD and expression of VEGF.

Endostatin HepG-2 Xenograft tumor model Antiangiogenesis

310014 浙江省人民醫(yī)院

*通訊作者