劉建青(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014030)

內(nèi)生真菌是指在植物體內(nèi)完成其生活史的部分或全部，分布于植物各個(gè)組織和器官中，但又不引起任何病癥的微生物，與植物是一種互利互惠的共生關(guān)系［1］。由于內(nèi)生菌普遍存在于植物體內(nèi)，在生物防治方面比葉圍、根圍等微生物更具有應(yīng)用潛力，因此，用內(nèi)生菌來(lái)防治植物細(xì)菌病害、線蟲(chóng)病害和真菌病害的研究報(bào)道較多［2－3］，且越來(lái)越受到植物病理學(xué)家的重視。然而，目前有關(guān)小麥內(nèi)生菌分離、應(yīng)用方面的報(bào)道很少［4－6］，在國(guó)內(nèi)亦是空白。為此，筆者選用7種培養(yǎng)基，對(duì)內(nèi)蒙古包頭市土右旗小麥不同部位的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化，探討了內(nèi)生真菌在小麥種子及根、莖、葉等不同部位的分布情況，旨在為進(jìn)一步研究小麥內(nèi)生菌的應(yīng)用以及內(nèi)生菌對(duì)小麥主要病害的生物防治作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料與試劑。水溶性淀粉、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、NaOH、葡萄糖、蔗糖、MgSO4·7H2O、麥芽糖等購(gòu)自天津永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;蛋白胨、維生素、瓊脂、硝酸鈉、氯化鉀、硫酸亞鐵、梭甲基纖維素、NH4NO3、酵母膏、孟加拉紅培養(yǎng)基、牛肉膏等購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;馬鈴薯購(gòu)自包頭市場(chǎng)。

1.1.2 主要儀器。尼康YS100型生物顯微鏡，北京博翔興旺科技有限公司;YXQ-LS-50型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;HHBⅡ型恒溫培養(yǎng)箱，天津?qū)嶒?yàn)儀器廠;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰有限公司;電熱恒溫水浴鍋，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司。

1.1.3 培養(yǎng)基。該驗(yàn)共選用7種培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、察氏培養(yǎng)基、梭甲基纖維素培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。另外，為防止細(xì)菌污染，培養(yǎng)基倒平板時(shí)，待溫度冷卻到45℃左右時(shí)，加100 μg/ml硫酸鏈霉素。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集。從包頭市土右旗7個(gè)地塊分期、分部位取樣，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x取樣品進(jìn)行菌種分離。

1.2.2 小麥各部位表面消毒［7］。選用次氯酸鈉作為消毒劑。用自來(lái)水沖洗小麥種子后，在75%乙醇中浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗3次，用3.0%次氯酸鈉浸泡9 min，75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水清洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分后備用。小麥的根、莖、葉等其他部位的次氯酸鈉消毒時(shí)間為7 min。

1.2.3 小麥內(nèi)生真菌分離純化。

1.2.3.1 分離。初步清洗小麥的種子或組織，在無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行表面消毒，接種到培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落，對(duì)單菌落進(jìn)行分離和保存，顯微觀察，鑒定各種內(nèi)生真菌。

1.2.3.2 純化。內(nèi)生真菌長(zhǎng)出菌絲或者孢子后，用接種針挑取菌絲或孢子轉(zhuǎn)接到PDA的培養(yǎng)基平板對(duì)其進(jìn)行純化，分離出單菌落。

1.2.4 內(nèi)生真菌形態(tài)鑒定［8－10］。內(nèi)生真菌形態(tài)鑒定包括菌落形態(tài)觀察以及顯微鑒定。其中，菌落形態(tài)包括菌落大小、質(zhì)地、顏色、菌絲粗細(xì)和長(zhǎng)短等;顯微鑒定用臨時(shí)裝片法，顯微特征包括菌絲的性狀、有無(wú)隔、寬度、是否分支等。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥各部分內(nèi)生真菌分離率 小麥有5個(gè)不同生長(zhǎng)期(出苗期、分蘗期、拔節(jié)期、乳熟期、臘熟期)，對(duì)小麥拔節(jié)期各部分內(nèi)生真菌的分離率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由圖1可知，種子部位的內(nèi)生真菌分離率較高，為28.03%。原因可能是有些小麥種植初形成時(shí)內(nèi)部就帶有真菌，隨著種子的成熟，種子內(nèi)部帶菌率逐漸提高。而內(nèi)生真菌在莖、葉等部位的定殖率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在種子的定殖率，因此，在小麥生長(zhǎng)的拔節(jié)期則表現(xiàn)為種子內(nèi)部的內(nèi)生真菌分離率較高。

2.2 小麥內(nèi)生真菌的鑒定 通過(guò)對(duì)分離得到的真菌的菌落形態(tài)分析及顯微鑒定，初步鑒定出以下幾個(gè)屬。

2.2.1 鏈格孢屬菌(Alternaria sp.)。PDA培養(yǎng)基上比較菌絲發(fā)達(dá)，菌落初期白色，后期變?yōu)榛疑虿煌潭鹊暮稚?菌絲有隔，多分枝，大量產(chǎn)孢子，淡褐色至褐色;分生孢子梗單生或簇生(圖2)。

2.2.2 木霉屬(Trichoderma sp.)。其菌絲體為無(wú)色，初期白色，后期變白色夾雜青綠色;分生孢子梗分枝;分生孢子近球形、倒卵形、橢圓形，單胞，無(wú)色，在瓶梗頂端聚集成孢子頭(圖3)。

2.2.3 青霉屬(Penicillium sp.)。菌絲體比較發(fā)達(dá)，初期白色，后期呈藍(lán)綠色;分生孢子梗直立，頂端具對(duì)稱或不對(duì)稱的單輪、二輪至多輪掃帚狀分枝，頂層為瓶狀小梗;分生孢子多為球形、柱形、橢圓形，無(wú)色或淡色(圖4)。

2.2.4 根霉屬(Rhizopus sp.)。其菌絲粗且較長(zhǎng)，經(jīng)常迅速長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)生菌落不定形，初期為白色，后期會(huì)出現(xiàn)黑色顆粒;菌絲無(wú)隔、多核、分枝狀;孢子囊梗單生或叢生，頂端著生球狀的孢子囊，囊內(nèi)有許多孢囊孢子(圖5)。

2.2.5 離蠕抱屬(Bipolaris sp.)。其菌落為深灰色或深褐色，與鏈格孢屬相類似，但邊緣整齊;其菌絲體呈暗色;分生孢子梗單生或者簇生，上部膝狀折曲;分生孢子紡錘形，微彎(圖6)。

2.2.6 曲霉屬(Aspergillus sp.)。其菌絲體比較發(fā)達(dá)，顏色變化較大，由淡黃色至黃綠色或黑色;分生孢子梗頂端膨大成球形、半球形或棍棒狀的頂囊，上生單層或雙層瓶狀小梗;分生孢子橢圓形，卵圓形，無(wú)色(圖7)。

2.2.7 類酵母菌(Saccharomyces)。無(wú)菌絲，為白色圓點(diǎn)，孢子有核(圖8)。

2.2.8 未知菌。初期為白色，生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)后為淡黃色，蓮花狀，無(wú)菌絲(圖9)，未鑒定出何種菌。

2.3 小麥內(nèi)生真菌在宿主中的分布規(guī)律分析 在小麥生長(zhǎng)過(guò)程中，根與種子的內(nèi)生真菌分離率最高，莖部次之。葉內(nèi)生真菌含量最少，原因可能是，隨著小麥生長(zhǎng)，植株體內(nèi)可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸增多，感染的真菌在植株體內(nèi)不斷生長(zhǎng)繁殖，故生物量逐漸增多，到小麥成熟期，植株組織己經(jīng)開(kāi)始老化，各組織表面通透性增強(qiáng)，外界菌群極易進(jìn)入植株體內(nèi)，導(dǎo)致真菌分離率很高［11］。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用經(jīng)典的內(nèi)生真菌研究方法，對(duì)包頭市土右旗小麥各時(shí)期、各部位內(nèi)生真菌多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，在顯微鏡下觀察到一些內(nèi)生真菌并對(duì)其進(jìn)行了鑒定。但是傳統(tǒng)的分離方法具有一定的局限性，因此，要想分離觀察到全部?jī)?nèi)生真菌，還需要配合分子生物學(xué)方法來(lái)研究?jī)?nèi)生真菌多樣性，如直接提取小麥組織的DNA，特異性PCR后，進(jìn)行序列分析，可以鑒定無(wú)法分離培養(yǎng)的內(nèi)生真菌。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明小麥內(nèi)生真菌的分離是可以實(shí)現(xiàn)的，為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)生真菌與小麥之間的相互作用關(guān)系提供了實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

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