周松林，丁 潔，趙喚閣，黃用豪，林映瑩(海南省熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口571199)

酸漿(Physalis alkekengi.Linn)為茄科植物酸漿屬的干燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼［1］，酸漿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，名酸醬，其后歷代本草多有收載，明·李時(shí)珍《本草綱目》中記載燈籠草利濕除熱、清肺治咳、利濕化痰、治疽，《本草綱目拾遺》［2］中云:“燈籠草，……經(jīng)霜乃紅，京師呼為紅姑娘。按此草主治雖多，惟咽喉是其專治，用之功最捷?！院?、治咽喉腫如神。酸漿原產(chǎn)于南美洲，在我國野生資源十分豐富，能抗病蟲害，生命力極強(qiáng)［3］。我國酸漿屬約5種，南北均產(chǎn)，海南1種，即小果酸漿(Physalis minima)，主要分布于中南及西南地區(qū)，海南低海拔地區(qū)常見，生于曠野、荒地及路旁等處［4］。酸漿全草含有酸漿苦素A-T(Physailin A-T)等苦味素類化合物(physalins)和黃酮類化合物如木犀草素(luleolsn，3'，4'，5，7-四羥基黃酮)、木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷、酸漿黃酮醇等，以及甾醇類化合物如β-谷甾醇、馬尾藻甾醇(24ε-羥基-24-乙烯基膽甾醇)等［5－11］。由于不同采收期小果酸漿中的成分有一定變化，從而影響到用藥的療效，因此需對(duì)小果酸漿的化學(xué)成分進(jìn)行全面地評(píng)價(jià)，以保證用藥安全及療效的穩(wěn)定性。近些年，指紋圖譜技術(shù)得到廣泛應(yīng)用［12－14］，筆者采用HPLC-UV-MS法建立了小果酸漿的HPLC指紋圖譜，得到能夠標(biāo)示其特性的共有色譜峰圖譜，再通過高分辯率的LC-MS鑒定其共有色譜峰，為小果酸漿藥材的采收及其內(nèi)在質(zhì)量的均一性提供全面的質(zhì)量控制依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 雙光束紫外可見分光光度計(jì):HITACHI U-2900型;高效液相色譜儀:HITACHI L-2000型(檢測(cè)器:L-2420;泵:L-2130;色譜柱:L-2300;進(jìn)樣器:L-2200);色譜柱:LaChrom C18(4.6 mm×150 mm);液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀:ABSciex API4000三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀;電子天平:METTLER TOLEDO PL2002;超聲波清洗器:JN-5200DTD。

1.2 試藥 所用海南小果酸漿藥材于不同季節(jié)在海南?？诿郎岷优圆杉?，并由海南醫(yī)學(xué)院曾開念博士鑒定為小果酸漿Physalis minima Linn.，樣品分別陰干、粉碎過80目后供分析用。藥材編號(hào)、來源、采集時(shí)間見表1。甲醇、乙腈均為TEDIA色譜純;乙酸、磷酸為國產(chǎn)分析純;水為實(shí)驗(yàn)室自制18.2Ω的超凈水，經(jīng)超聲洗滌器超聲。所配置的流動(dòng)相均通過0.45 μm 的濾膜過濾。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的配制。分別取不同批次的樣品小酸漿粉末3.00 g，加15 ml甲醇搖勻，超聲提取6 h，提取液置于50 ml棕色容量瓶中，重復(fù)2次，合并3次提取液于容量瓶中，定容。取溶液經(jīng)微孔濾膜濾過，濾液備用。

1.3.2 HPLC 條件摸索。掃描顯示在波長 238、381、394、410、468、536 nm時(shí)均有吸收峰，其中在238 nm的吸收峰最為明顯。同時(shí)參考相關(guān)文獻(xiàn)［6－9，15－16］并考慮到色譜柱的差異，在相同色譜條件下(流動(dòng)相:乙腈－0.1%磷酸20∶80;流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量 10 μl)，用 220、230、240、260，380，390 nm不同檢測(cè)波長進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)波長230 nm時(shí)，各峰吸收面積最大，故確定230 nm為檢測(cè)波長。

參考相關(guān)文獻(xiàn)［6－9，15－16］，以此色譜柱初步擬定以下幾種溶液為流動(dòng)相。a:甲醇－2%醋酸(45∶55，V/V)、b:甲醇－乙腈 －0.1%磷酸(5∶15∶80，V/V/V)、c:乙腈 －0.1%磷酸(34∶66/20∶80/15∶85)，在相同色譜條件下(檢測(cè)波長 230 nm;流速 1.0 ml/min，進(jìn)樣量 10 μl)，分別以 a，b，c(3 種比例)為流動(dòng)相進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)c在15∶85時(shí)波峰峰型較高，分離度較高，波峰面積較大，故確定乙腈 －0.1%磷酸(15∶85，V/V)為流動(dòng)相條件。

分別取樣品濾液 1 ml稀釋至 1、2、5、10、20 和 50 倍，在相同色譜條件下(流動(dòng)相∶乙腈－0.1%磷酸20∶80;檢測(cè)波長:230nm;流速 1.0 ml/min，進(jìn)樣量 10 μl)，發(fā)現(xiàn)在稀釋 5 倍時(shí)不僅分離度較好，且峰面積較大，故選擇將樣品溶液稀釋5倍后分析。

1.3.3 質(zhì)譜條件。質(zhì)譜采用電噴霧離子化方式，正離子模式，掃描范圍m/z 100～1 000;噴射電壓為5 500 V;干燥氣流速10 L/min，干燥氣溫度550℃，霧化室壓21 758 Mpa，毛細(xì)管電壓4 kV;傳輸電壓70 V，進(jìn)樣量5 μl。

1.3.4 指紋圖譜的建立與共有指紋峰的指認(rèn)。

1.3.4.1 指紋圖譜的建立。取“1.3.1”制備的供試品溶液稀釋5 倍后各10 μl，在“1.3.2”所述條件下進(jìn)行測(cè)定，得到5批不同批次小果酸漿HPLC指紋圖譜，根據(jù)色譜圖中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，確定共有峰，并選取其中20個(gè)共有峰作為特征指紋峰，建立的指紋圖譜見圖1。

1.3.4.2 共有指紋峰的標(biāo)定。小果酸漿HPLC指紋圖譜中，從42個(gè)峰中得到共有指紋峰20個(gè)，其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見表2和3。

1.3.4.3 共有指紋峰的指認(rèn)。采用Q-TOF-MS-IDA-MS/MS技術(shù)，參考相關(guān)文獻(xiàn)［5－11］，對(duì)HPLC指紋圖譜20個(gè)共有峰中的14個(gè)色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)，結(jié)果見表4。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度 取同一供試品溶液按“1.3.2”條件連續(xù)測(cè)定5次，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.3%，相對(duì)峰面積RSD＜3.0%。

2.2 穩(wěn)定性 取同一供試品溶液按“1.3.2”條件，分別在0、4、8、12、24 h測(cè)定其指紋圖譜，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.5%，相對(duì)峰面積RSD＜5.0%。

2.3 重復(fù)性 按照“1.3.1”供試品溶液制備方法平行處理同一批次樣品5份，按“1.3.2”條件分別測(cè)定，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD ＜0.5%，相對(duì)峰面積 RSD ＜5.0%。

表2 小果酸漿共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3 小果酸漿不同季節(jié)共有峰的相對(duì)峰面積

表4 小果酸漿指紋圖譜共有峰的指認(rèn)結(jié)果

3 討論

指紋圖譜是目前控制中藥材質(zhì)量最有效、最直觀的手段之一。該研究采用HPLC-UV-MS方法，建立了小果酸漿不同季節(jié)的指紋圖譜。結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好，可為小果酸漿質(zhì)量分析、評(píng)價(jià)與控制提供依據(jù)。

從該試驗(yàn)結(jié)果看，不同季節(jié)的小果酸漿成分含量是有變化的，相對(duì)而言，在7月份采集時(shí)苦味素類含量較高，但總峰面積與共有峰總面積卻是4月份最高，因而在采集小果酸漿某種成分時(shí)，可在其含量水平最高的季節(jié)采集，為小果酸漿在臨床治療提供理論支持。

由于該試驗(yàn)HPLC-UV儀器采用日本HITACH公司的LC2000，所獲得的數(shù)據(jù)無法通過國家藥典委員會(huì)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版軟件進(jìn)行相似度評(píng)估，建議國家藥典委員會(huì)在編寫新版的版軟件進(jìn)行相似度評(píng)估系統(tǒng)時(shí)，考慮到其他系統(tǒng)的版本，所要求的“TXT”及ASII碼編寫文檔更簡便、大眾化些。

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