徐 鑫，劉 婭，楊 麗 (石河子大學食品學院，新疆石河子832003)

生物表面活性劑(Biosurfactants，簡稱BS)是微生物等通過生物發(fā)酵，產生的具有親水基與憎水基的有機大分子化合物［1］。生物表面活性劑的結構相對于化學表面活性劑的種類與結構更加復雜。生物表面活性劑一般分為五大類，包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂以及中類脂衍生物等［2］。由于生物表面活性劑具有很多功能特點，廣泛應用于醫(yī)藥、農業(yè)、化妝品、食品工業(yè)、石油工業(yè)和生物環(huán)境修復等領域［3－4］。相對于化學合成的表面活性劑，生物表面活性劑在食品行業(yè)中有著尤為突出的優(yōu)勢。由于生物表面活性劑對于食品具有無毒或低毒、容易被生物降解、附著控制與阻止微生物大量滋生等優(yōu)點［5－6］，近年來，在食品行業(yè)中對生物表面活性劑的研究日益增多。因此，生物表面活性劑在食品行業(yè)中具有深遠廣闊的應用前景［7］。

筆者運用油平板法、排油圈法［8］等方法對從葡萄中篩選出的72株菌株進行初篩與復篩，初步篩選出產生物表面活性劑的最佳菌株，對其進行菌種鑒定，通過酸沉降與有機萃取法提取粗產物，并通過薄層層析試驗、紅外光譜分析等鑒定生物表面活性劑類型，為研究脂肽類生物表面活性劑的產生與應用打下堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種。由筆者課題組從葡萄中分離篩選獲得，共72株，包括細菌、酵母菌和霉菌。

1.1.2 培養(yǎng)基。油平板培養(yǎng)基:硫酸銨10.0 g/L;磷酸氫二鉀4.5 g/L;磷酸二氫鉀3.5 g/L;硫酸鎂1.0 g/L;氯化鈉1.5 g/L;氯化鉀1.5 g/L;瓊脂粉 15.0 g/L;V(液體石蠟)∶V(橄欖油)=1∶11.5;pH 7。

菌種保藏培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g/L;瓊脂20.0 g/L;氯化鈉4.0 g/L;瓊脂 20.0 g/L;pH 7。

種子培養(yǎng)基:氯化鈉4.0 g/L;蛋白胨10.0 g/L;牛肉膏3.0 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基:機油 20.0 g/L;硫酸銨3.0 g/L;硫酸鎂0.5 g/L;磷酸氫二鈉4.0 g/L;氯化鈉 4.0 g/L;磷酸二氫鉀 4.0 g/L;pH 7。

1.1.3 主要儀器設備。SVY-CF-1F超凈工作臺，KBF720恒溫恒濕培養(yǎng)箱，5810R型高速冷凍離心機，MLS-3750高壓滅菌鍋，F(xiàn)A1004電子天平，Genex Beta移液槍，MOTIC B SERIES生物顯微鏡，IRPrestige-21日本島津紅外光譜儀。

1.2 方法

1.2.1 產生物表面活性劑菌株的初步篩選。通過培養(yǎng)將分離后得到的72株葡萄內生菌菌株接種于油平板表面，然后放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，觀察每株待測菌株菌的擴油圈的生成。只有產出生物表面活性劑的菌株能夠乳化油脂類物質才在吸收橄欖油的條件下形成較為明顯的擴油圈，故后續(xù)研究應選擇在培養(yǎng)皿表面具有相對明顯擴油圈的菌落。

1.2.2 產生物表面活性劑菌株的復篩。將C2J6發(fā)酵液置于離心機中條件為8 000 r/min離心20 min，抽取上清液。加14 ml蒸餾水于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，并向水面滴加1 ml橄欖油經蘇丹Ⅲ染色形成油膜。在穩(wěn)定油膜中心滴加300 μl發(fā)酵上清液，待液面穩(wěn)定并且發(fā)酵液將油圈液面由中心擴至圓形后測其直徑即排油圈直徑，并分別測其表面張力，選取排油圈直徑最大與表面張力數(shù)值最小的菌株作鑒定研究。

1.2.3 菌株的鑒定。

1.2.3.1 菌株的形態(tài)觀察。將葡萄內生菌菌株C2J6接種于28℃恒溫牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放置3 d后通過顯微鏡觀察C2J6菌落形態(tài)。

1.2.3.2 26S rDNA 的擴增與測序。采用26S rDNA對篩選出的C2J6菌株進行分子鑒定。稀釋涂布法將菌接種于PDA平板上，28℃過夜培養(yǎng)。DNA的提取方法按照文獻引物序列:上游引物為5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';下游引物為5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR擴增程序:94℃預變性5 min;94℃變性30 s后，57℃退火45 s，72℃延伸時長1 min，在35個循環(huán)后;72℃再延伸10 min時長。PCR反應體系為50 μl。經過EB染色、用紫外凝膠成像儀進行分析1%瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產物，并送由外部檢測，測定方為上海市美吉生物工程有限公司。

1.2.4 生物表面活性劑的初步鑒定。

1.2.4.1 生物表面活性劑的粗提薄層層析檢測。將發(fā)酵液放置于離心機中在8 000 r/min離心30 min去除菌液當中的微生物菌體與雜質。將收集到的C2J6培養(yǎng)上清液用6 mol/L濃HCl調至pH 2.0，放置于4℃冰箱靜置12 h，將過夜菌液放置于離心機8 000 r/min離心30 min收集沉淀。再用pH 2.0的HCl洗滌一次，隨后滴加1 mol/L NaOH溶液于該沉淀中，穩(wěn)定后使最終pH為7.0，冷凍干燥10 h，得到含有一定量雜質的固體表面活性劑粗品。將提取物放置到硅膠板上再用氯仿－乙酸溶劑展開，在高溫與密封條件下鹽酸水解后與茚三酮反應，在高溫下顯色。

1.2.4.2 生物表面活性劑的提純及紅外掃描。將“1.2.4.1”步提取出的生物表面活性劑粗品用體積比為2∶1的氯仿－甲醇混合液進行萃取試驗，放置于冷凍干燥機中，干燥過后即得生物表面活性劑樣品。取定量生物表面活性劑樣品進行紅外測定。

1.2.4.3 生物表面活性劑帶電性能的檢測。采用亞甲基藍－氯仿測定法與溴酚藍測定法測定其生物表面活性物質帶電性。

2 結果與分析

2.1 菌株的初篩與復篩 通過初篩得到9株明顯產出生物表面活性劑的菌種，并對其進行復篩試驗。試驗顯示，菌株C2J6產生的排油圈直徑最大。由此，可以判斷菌種C2J6產生表面活性劑的能力相對強力。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)特征。如圖1所示，C2J6在油平板培養(yǎng)基上菌落呈圓形態(tài)，黑色沙粒狀孢子由中心向邊緣由密集到逐漸稀疏，邊緣為乳白色緊密且較為短小的絨毛狀菌絲。在顯微形態(tài)下為無色半透明狀的無隔菌絲，較為多次的分枝，且分枝頂端較為膨大，無假根，上顯小梗，孢囊梗直立，圓形孢子呈現(xiàn)熟鏈狀分布，表象為一串“分生孢子”。

2.2.2 C2J6 PCR擴增與菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的建立。對C2J6進行26S rDNA進行PCR擴增，擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(120 V 20 min)，電泳結果見圖2。C2J6菌株26S rDNA的PCR產物測序結果于NCBI上進行同源性分析，對C2J6進行進化樹分析，結果見圖3，發(fā)現(xiàn)與黑曲霉有100%的同源性，確定其分類地位為黑曲霉菌株(Aspergillus niger)。

2.3 發(fā)酵產出生物表面活性劑的薄層層析 對C2J6菌株產出的生物表面活性劑粗樣品進行薄層層析分析，結果如圖4。由圖4可見，在0.5%的無水丙酮茚三酮溶液呈現(xiàn)出紫紅色印記，表明黑曲霉C2J6菌株培養(yǎng)產生的生物表面活性物質為脂肽類。

2.4 紅外光譜分析 菌株C2J6的干燥樣品經KBr壓片法做紅外檢測測定。由圖5可見，在 FT-IR光譜圖上，樣品位于3 450～3 250 cm－1范圍有一較為明顯的寬吸收峰，且最強吸收峰值為3 354 cm－1。通過查詢可得樣品分子具有N－H和C－H鍵的伸縮振動，則該生物表面活性劑含有氨基碳氫化合物。位于1 629 cm－1與1 544 cm－1譜帶為2個酰胺鍵特征譜帶，則該樣品中含有肽鍵物質，表明該樣品肽鏈為親水基。在1 720 cm－1顯示有一個C=O的伸縮振動峰，而2 926～2 823 cm－1和1 427～1 350 cm－1的伸縮振動峰為脂肪碳鏈中的C－H鍵，表明脂肪酸鏈為該生物表面活性劑分子的疏水基部分，為憎水端。因此，菌株C2J6發(fā)酵得到的為脂肽類生物表面活性劑。

2.5 C2J6發(fā)酵產物帶電性能的檢測 檢測C2J6發(fā)酵產物帶電性，根據(jù)對陰、陽離子生物表面活性劑測定，發(fā)現(xiàn)陰離子氯仿檢測層變?yōu)樗{色，而陽離子檢測未發(fā)生顏色改變，表明該產物是陰離子生物表面活性劑。

3 結論

該研究從新疆釀酒葡萄分離出的72株菌株中篩選并分離得到1株性能良好的產生物表面活性劑菌株C2J6。結合形態(tài)學觀察和26S rDNA同源性分析初步鑒定，菌株C2J6為黑曲霉菌株(Aspergillus niger)。經薄層層析與紅外分析鑒定，C2J6菌株發(fā)酵液產物為脂肽類表面活性劑，其帶電性能為陰離子型。該研究結果為產脂肽類生物表面活性劑擴充了葡萄內生菌C2J6菌種，為脂肽類生物表面活性劑在食品領域的應用提供了較為有力的理論基礎。后續(xù)研究將更加著重于對該生物表面活性劑的適應環(huán)境與應用特點，并有望大力推進脂肽類生物表面活性劑研究的內容與應用展望。

［1］YOUSSEF N H，DUNCAN K E，NAGLE D P，et al.Comparison of methods to detect biosurfactant productionby diverse microorgaisms［J］.Journal of Microbiological Methods，2004，56(3):339 －347.

［2］NITSCHKEA M，COSTA S G V A O.Biosurfactants in food industry［J］.Trends in Food Science ＆ Technology，2007，18:252 －259.

［3］LEE S C，LEE S J，KIM S H.Characterization of new biosurfactant produced by Klebsiella sp.Y6-1 isolated from waste soybean oil［J］.Bioresource Technology，2008，99(7):2288 －2292.

［4］張?zhí)靹?生物表面活性劑及其應用［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2005:218－363.

［5］向智男，寧正祥.生物表面活性劑及其在食品工業(yè)中的應用［J］.糧油食品科技，2005，13(1):50 －52.

［6］LUKONDEH T，ASHBOLH N J，ROGERS P L.Evaluation of Kluyveromyces marxianus FII 510700 grown on a lactose-based medium as a source of natural bioemulsifier［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2003，30:715 －720.

［7］侯占群，高彥祥.生物表面活性劑及其在食品工業(yè)中的應用進展［J］.食品研究與開發(fā)，2010(4):170－174.

［8］YOUSSEF N H，DUNEAN K E，NAGLE D P.Comparison of methods to deteet biosurfactant produetion by diverse mieroorganisms［J］.Joumal of Microbiologieal Methods，2004，56:339 －347.