徐 鑫,劉 婭,楊 麗 (石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子832003)
生物表面活性劑(Biosurfactants,簡(jiǎn)稱BS)是微生物等通過(guò)生物發(fā)酵,產(chǎn)生的具有親水基與憎水基的有機(jī)大分子化合物[1]。生物表面活性劑的結(jié)構(gòu)相對(duì)于化學(xué)表面活性劑的種類與結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜。生物表面活性劑一般分為五大類,包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂以及中類脂衍生物等[2]。由于生物表面活性劑具有很多功能特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化妝品、食品工業(yè)、石油工業(yè)和生物環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域[3-4]。相對(duì)于化學(xué)合成的表面活性劑,生物表面活性劑在食品行業(yè)中有著尤為突出的優(yōu)勢(shì)。由于生物表面活性劑對(duì)于食品具有無(wú)毒或低毒、容易被生物降解、附著控制與阻止微生物大量滋生等優(yōu)點(diǎn)[5-6],近年來(lái),在食品行業(yè)中對(duì)生物表面活性劑的研究日益增多。因此,生物表面活性劑在食品行業(yè)中具有深遠(yuǎn)廣闊的應(yīng)用前景[7]。
筆者運(yùn)用油平板法、排油圈法[8]等方法對(duì)從葡萄中篩選出的72株菌株進(jìn)行初篩與復(fù)篩,初步篩選出產(chǎn)生物表面活性劑的最佳菌株,對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定,通過(guò)酸沉降與有機(jī)萃取法提取粗產(chǎn)物,并通過(guò)薄層層析試驗(yàn)、紅外光譜分析等鑒定生物表面活性劑類型,為研究脂肽類生物表面活性劑的產(chǎn)生與應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
1.1 材料
1.1.1 試驗(yàn)菌種。由筆者課題組從葡萄中分離篩選獲得,共72株,包括細(xì)菌、酵母菌和霉菌。
1.1.2 培養(yǎng)基。油平板培養(yǎng)基:硫酸銨10.0 g/L;磷酸氫二鉀4.5 g/L;磷酸二氫鉀3.5 g/L;硫酸鎂1.0 g/L;氯化鈉1.5 g/L;氯化鉀1.5 g/L;瓊脂粉 15.0 g/L;V(液體石蠟)∶V(橄欖油)=1∶11.5;pH 7。
菌種保藏培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g/L;瓊脂20.0 g/L;氯化鈉4.0 g/L;瓊脂 20.0 g/L;pH 7。
種子培養(yǎng)基:氯化鈉4.0 g/L;蛋白胨10.0 g/L;牛肉膏3.0 g/L。
發(fā)酵培養(yǎng)基:機(jī)油 20.0 g/L;硫酸銨3.0 g/L;硫酸鎂0.5 g/L;磷酸氫二鈉4.0 g/L;氯化鈉 4.0 g/L;磷酸二氫鉀 4.0 g/L;pH 7。
1.1.3 主要儀器設(shè)備。SVY-CF-1F超凈工作臺(tái),KBF720恒溫恒濕培養(yǎng)箱,5810R型高速冷凍離心機(jī),MLS-3750高壓滅菌鍋,F(xiàn)A1004電子天平,Genex Beta移液槍,MOTIC B SERIES生物顯微鏡,IRPrestige-21日本島津紅外光譜儀。
1.2 方法
1.2.1 產(chǎn)生物表面活性劑菌株的初步篩選。通過(guò)培養(yǎng)將分離后得到的72株葡萄內(nèi)生菌菌株接種于油平板表面,然后放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d,觀察每株待測(cè)菌株菌的擴(kuò)油圈的生成。只有產(chǎn)出生物表面活性劑的菌株能夠乳化油脂類物質(zhì)才在吸收橄欖油的條件下形成較為明顯的擴(kuò)油圈,故后續(xù)研究應(yīng)選擇在培養(yǎng)皿表面具有相對(duì)明顯擴(kuò)油圈的菌落。
1.2.2 產(chǎn)生物表面活性劑菌株的復(fù)篩。將C2J6發(fā)酵液置于離心機(jī)中條件為8 000 r/min離心20 min,抽取上清液。加14 ml蒸餾水于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中,并向水面滴加1 ml橄欖油經(jīng)蘇丹Ⅲ染色形成油膜。在穩(wěn)定油膜中心滴加300 μl發(fā)酵上清液,待液面穩(wěn)定并且發(fā)酵液將油圈液面由中心擴(kuò)至圓形后測(cè)其直徑即排油圈直徑,并分別測(cè)其表面張力,選取排油圈直徑最大與表面張力數(shù)值最小的菌株作鑒定研究。
1.2.3 菌株的鑒定。
1.2.3.1 菌株的形態(tài)觀察。將葡萄內(nèi)生菌菌株C2J6接種于28℃恒溫牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,放置3 d后通過(guò)顯微鏡觀察C2J6菌落形態(tài)。
1.2.3.2 26S rDNA 的擴(kuò)增與測(cè)序。采用26S rDNA對(duì)篩選出的C2J6菌株進(jìn)行分子鑒定。稀釋涂布法將菌接種于PDA平板上,28℃過(guò)夜培養(yǎng)。DNA的提取方法按照文獻(xiàn)引物序列:上游引物為5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';下游引物為5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s后,57℃退火45 s,72℃延伸時(shí)長(zhǎng)1 min,在35個(gè)循環(huán)后;72℃再延伸10 min時(shí)長(zhǎng)。PCR反應(yīng)體系為50 μl。經(jīng)過(guò)EB染色、用紫外凝膠成像儀進(jìn)行分析1%瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產(chǎn)物,并送由外部檢測(cè),測(cè)定方為上海市美吉生物工程有限公司。
1.2.4 生物表面活性劑的初步鑒定。
1.2.4.1 生物表面活性劑的粗提薄層層析檢測(cè)。將發(fā)酵液放置于離心機(jī)中在8 000 r/min離心30 min去除菌液當(dāng)中的微生物菌體與雜質(zhì)。將收集到的C2J6培養(yǎng)上清液用6 mol/L濃HCl調(diào)至pH 2.0,放置于4℃冰箱靜置12 h,將過(guò)夜菌液放置于離心機(jī)8 000 r/min離心30 min收集沉淀。再用pH 2.0的HCl洗滌一次,隨后滴加1 mol/L NaOH溶液于該沉淀中,穩(wěn)定后使最終pH為7.0,冷凍干燥10 h,得到含有一定量雜質(zhì)的固體表面活性劑粗品。將提取物放置到硅膠板上再用氯仿-乙酸溶劑展開(kāi),在高溫與密封條件下鹽酸水解后與茚三酮反應(yīng),在高溫下顯色。
1.2.4.2 生物表面活性劑的提純及紅外掃描。將“1.2.4.1”步提取出的生物表面活性劑粗品用體積比為2∶1的氯仿-甲醇混合液進(jìn)行萃取試驗(yàn),放置于冷凍干燥機(jī)中,干燥過(guò)后即得生物表面活性劑樣品。取定量生物表面活性劑樣品進(jìn)行紅外測(cè)定。
1.2.4.3 生物表面活性劑帶電性能的檢測(cè)。采用亞甲基藍(lán)-氯仿測(cè)定法與溴酚藍(lán)測(cè)定法測(cè)定其生物表面活性物質(zhì)帶電性。
2.1 菌株的初篩與復(fù)篩 通過(guò)初篩得到9株明顯產(chǎn)出生物表面活性劑的菌種,并對(duì)其進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。試驗(yàn)顯示,菌株C2J6產(chǎn)生的排油圈直徑最大。由此,可以判斷菌種C2J6產(chǎn)生表面活性劑的能力相對(duì)強(qiáng)力。
2.2 菌株鑒定
2.2.1 形態(tài)特征。如圖1所示,C2J6在油平板培養(yǎng)基上菌落呈圓形態(tài),黑色沙粒狀孢子由中心向邊緣由密集到逐漸稀疏,邊緣為乳白色緊密且較為短小的絨毛狀菌絲。在顯微形態(tài)下為無(wú)色半透明狀的無(wú)隔菌絲,較為多次的分枝,且分枝頂端較為膨大,無(wú)假根,上顯小梗,孢囊梗直立,圓形孢子呈現(xiàn)熟鏈狀分布,表象為一串“分生孢子”。
2.2.2 C2J6 PCR擴(kuò)增與菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的建立。對(duì)C2J6進(jìn)行26S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(120 V 20 min),電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。C2J6菌株26S rDNA的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果于NCBI上進(jìn)行同源性分析,對(duì)C2J6進(jìn)行進(jìn)化樹分析,結(jié)果見(jiàn)圖3,發(fā)現(xiàn)與黑曲霉有100%的同源性,確定其分類地位為黑曲霉菌株(Aspergillus niger)。
2.3 發(fā)酵產(chǎn)出生物表面活性劑的薄層層析 對(duì)C2J6菌株產(chǎn)出的生物表面活性劑粗樣品進(jìn)行薄層層析分析,結(jié)果如圖4。由圖4可見(jiàn),在0.5%的無(wú)水丙酮茚三酮溶液呈現(xiàn)出紫紅色印記,表明黑曲霉C2J6菌株培養(yǎng)產(chǎn)生的生物表面活性物質(zhì)為脂肽類。
2.4 紅外光譜分析 菌株C2J6的干燥樣品經(jīng)KBr壓片法做紅外檢測(cè)測(cè)定。由圖5可見(jiàn),在 FT-IR光譜圖上,樣品位于3 450~3 250 cm-1范圍有一較為明顯的寬吸收峰,且最強(qiáng)吸收峰值為3 354 cm-1。通過(guò)查詢可得樣品分子具有N-H和C-H鍵的伸縮振動(dòng),則該生物表面活性劑含有氨基碳?xì)浠衔?。位? 629 cm-1與1 544 cm-1譜帶為2個(gè)酰胺鍵特征譜帶,則該樣品中含有肽鍵物質(zhì),表明該樣品肽鏈為親水基。在1 720 cm-1顯示有一個(gè)C=O的伸縮振動(dòng)峰,而2 926~2 823 cm-1和1 427~1 350 cm-1的伸縮振動(dòng)峰為脂肪碳鏈中的C-H鍵,表明脂肪酸鏈為該生物表面活性劑分子的疏水基部分,為憎水端。因此,菌株C2J6發(fā)酵得到的為脂肽類生物表面活性劑。
2.5 C2J6發(fā)酵產(chǎn)物帶電性能的檢測(cè) 檢測(cè)C2J6發(fā)酵產(chǎn)物帶電性,根據(jù)對(duì)陰、陽(yáng)離子生物表面活性劑測(cè)定,發(fā)現(xiàn)陰離子氯仿檢測(cè)層變?yōu)樗{(lán)色,而陽(yáng)離子檢測(cè)未發(fā)生顏色改變,表明該產(chǎn)物是陰離子生物表面活性劑。
該研究從新疆釀酒葡萄分離出的72株菌株中篩選并分離得到1株性能良好的產(chǎn)生物表面活性劑菌株C2J6。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和26S rDNA同源性分析初步鑒定,菌株C2J6為黑曲霉菌株(Aspergillus niger)。經(jīng)薄層層析與紅外分析鑒定,C2J6菌株發(fā)酵液產(chǎn)物為脂肽類表面活性劑,其帶電性能為陰離子型。該研究結(jié)果為產(chǎn)脂肽類生物表面活性劑擴(kuò)充了葡萄內(nèi)生菌C2J6菌種,為脂肽類生物表面活性劑在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了較為有力的理論基礎(chǔ)。后續(xù)研究將更加著重于對(duì)該生物表面活性劑的適應(yīng)環(huán)境與應(yīng)用特點(diǎn),并有望大力推進(jìn)脂肽類生物表面活性劑研究的內(nèi)容與應(yīng)用展望。
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