·論著·

不同促透劑對姜黃素凝膠體外透皮作用的影響

田芳，胡晉紅*(第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部，上海 200433)

[摘要]目的：制備姜黃素凝膠的外用制劑，考察不同促透劑對姜黃素凝膠的促透作用。方法：建立一種快速、靈敏的液質(zhì)聯(lián)用定量分析方法，以裸小鼠離體皮膚為滲透屏障，姜黃素為模型藥物，F(xiàn)ranz立式擴散法考察各處方姜黃素的體外透皮特性，計算各凝膠處方的累積滲透參數(shù)。結果：姜黃素分析方法的線性范圍為10～800 ng/ml，定量下限為10 ng/ml；日內(nèi)、日間精密度良好，RSD均<15%；準確度符合要求。在1%的促透濃度下，6種促透劑對姜黃素的促透作用由強至弱依次為月桂氮酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、油酸、丙二醇、薄荷腦、卵磷脂。結論：姜黃素的HPLC-MS/MS分析方法符合要求，月桂氮酮對姜黃素具有顯著的促透作用。

[關鍵詞]姜黃素；促透劑；經(jīng)皮滲透；色譜法，高效液相；質(zhì)譜

[中圖分類號]R943[文獻標志碼]A

DOI：10.5428/pcar20150511

作者簡介田芳(男)，碩士.

[收稿日期]2015-09-01

Influence of different penetration ehhancer oninvitrotransdermal effect of curcumin gel

TIAN Fang, HU JinHong*(Department of Pharmacy, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433,China)

ABSTRACT[]Objective: To prepare curcumin gel with different penetration enhancer and study their skin permeation in vitro. Method: A rapid and sensitive HPLC-MS/MS quantitative method was established. Nude mouse skin was used as permeation barrier and curcumin was selected as a model drug. Franz diffusion method was adopted to investigate the in vitro transdermal characteristics and the cumulative penetration parameters of each curcumin gel were calculated. Results: The calibration curve of curcumin had satisfactory linearity within the range of 10-800 ng/ml and the lower limit of quantitation was 10 ng/ml. The intra-day and inter-day RSD were <15%, and accuracy met the specified requirements. Under 1% penetration enhancing concentration,the penetration enhancing effects of 6 enhancers on curcumin were in sequence: azone, N-methyl-2-pyrrolidone,oleic acid, propylene glycol, menthol and lecithin. Conclusion: The HPLC-MS/MS method of curcumin met the requirements,azone had outstanding transdermal effect on curcumin gel.

[KEY WORDS]curcumin；penetration enhancer；skin permeation；chromatography,high performance liquid;mass spectrometry

[Pharm Care Res，2015，15(5): 357-360]

E-mail: tfang2013@126.com

*通信作者(Corresponding author)：胡晉紅，E-mail: hjhong2016@126.com

姜黃素是從郁金、姜黃、莪術等姜科植物中提取的一種酚類化合物[1,2]，具有廣泛的藥理作用和生物學活性。但鑒于其自身的理化性質(zhì)，姜黃素口服后不易吸收，體內(nèi)代謝迅速，生物利用度低等因素[3,4]，尚未作為一種治療藥物在臨床使用。與口服給藥相比，經(jīng)皮給藥具有避免肝首關效應及胃腸滅活、維持恒定的血藥濃度、延長藥物作用時間等優(yōu)點。

本研究選用凝膠作為外用給藥劑型，在已有報道的基礎上選用月桂氮酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、油酸、丙二醇、薄荷腦、卵磷脂作為凝膠促透劑，采用1%(m/m)的濃度作為促透劑濃度，以不加促透劑的凝膠作為對照，制備出7種不同的姜黃素凝膠。此外，建立姜黃素定量分析的HPLC-MS/MS測定方法，通過該方法測定7種凝膠透皮后接收液的濃度，并以7種凝膠的12 h累計滲透量和滲透速率為考察指標，優(yōu)化出具有最佳促透作用的姜黃素凝膠，為姜黃素凝膠的經(jīng)皮給藥提供理論依據(jù)和實驗基礎。

1材料和方法

1.1試藥和儀器姜黃素原料藥由Sigma 公司提供；姜黃素對照品(規(guī)格20 mg，純度≥98.8%)、內(nèi)標和厚樸酚對照品(規(guī)格20 mg，純度≥98.8%)由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；冰乙酸(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)；月桂氮酮(分析純)、薄荷腦(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司；羥丙基纖維素、N-甲基-2-吡咯烷酮(分析純)、油酸(分析純)、丙二醇(分析純)和卵磷脂(分析純)購自上海源源化學試劑有限公司；乙醇(分析純，常熟市鴻盛精細化工有限公司)；氯化鈉(上海凌風化學試劑有限公司)；蒸餾水(屈臣氏集團)。

Aglient Extend C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)，Agilent Extend C18保護柱(12.5 mm×2.1 mm，5 μm)，三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國Aglient公司)；JA51001 電子天平(上海精天電子儀器有限公司)； XW-80A渦旋混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(上海躍進醫(yī)療器械廠)；Franz擴散池、透皮擴散儀(第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部)。

1.2實驗動物BALB/c裸小鼠，雄性，6～8周齡，體重(21.7±1.4) g, 購自第二軍醫(yī)大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2012-0016。

1.3實驗方法

這天晚上，阿東一直坐在床邊，看著阿里睡著。他心里很難過，不知道怎樣才能安慰阿里，也不知道怎樣才能幫到阿里。

1.3.1HPLC-MS/MS分析方法流動相為乙腈∶0.05%冰醋酸水溶液(55∶54，V/V)，流速0.3 ml/min，色譜柱溫度30 ℃，進樣量5 μl，樣品運行時間4.5 min。離子源為電噴霧離子源(ESI源)，負離子方式檢測，毛細管電壓4 kV，源溫度100 ℃，去溶劑化溫度350 ℃，去溶劑化氣體流速(N2) 6 L/min，輔助霧化氣(N2)壓力172.4 kPa (25 psi，1 psi=6.985 kPa)，分析中采用多離子反應監(jiān)測(multiple reaction monitor,MRM)定量，優(yōu)化后姜黃素和內(nèi)標(和厚樸酚)的MRM見表1。

表1　姜黃素與和厚樸酚多離子反應監(jiān)測參數(shù)

1.3.2Franz擴散池接收液的配制精密稱取氯化鈉0.9 g，溶解并稀釋至100 ml，制得濃度為0.9%的氯化鈉溶液(生理鹽水)。分別取乙醇和生理鹽水適量，按30∶70(V∶V)的比例制備濃度為30%的乙醇生理鹽水溶液。該溶液超聲脫氣30 min后作為空白接收液。

1.3.3對照品溶液的配制精密稱量姜黃素對照品0.01 g，用甲醇溶解并稀釋制得儲備液Ⅰ(100 μg/ml)和儲備液Ⅱ(10 μg/ml)。同法配制濃度為300 ng/ml的內(nèi)標和厚樸酚工作液。以姜黃素儲備液Ⅱ為母液，用空白接收液逐級稀釋，制得濃度為10、20、50、100、200、500、800 ng/ml的姜黃素系列標準溶液。取各濃度標準液30 μl加入5 μl和厚樸酚工作液，渦旋混勻后，進樣5 μl，用HPLC-MS/MS法測定。

1.3.4姜黃素凝膠的制備精密稱量羥丙基纖維素3 g，均勻撒于72 g蒸餾水中，溶脹過夜，制得姜黃素凝膠基質(zhì)。稱取姜黃素1 g，并用10 g無水乙醇超聲溶解，溶解后按表2項下的處方配比(即處方1至處方7)，分別加入各自處方劑量的促透劑(對照中加入等量的蒸餾水)，溶解并混勻，制得姜黃素溶液。將該溶液倒入姜黃素凝膠基質(zhì)，同時用總計7 g的無水乙醇潤洗制備姜黃素溶液所需器皿，潤洗后一并倒入姜黃素凝膠基質(zhì)，持續(xù)攪拌30 min后，加蒸餾水調(diào)整各處方至100 g，繼續(xù)攪拌30 min，直至姜黃素凝膠形成。

表2　姜黃素凝膠的組成

1.3.5離體皮膚的制備將裸小鼠頸椎脫臼處死，剪取背部皮膚，剝離皮下脂肪組織及筋膜，用等滲生理鹽水清洗皮膚至澄清，用鋁箔紙包裹后存放于-20 ℃冷凍保存，一周內(nèi)使用。

1.3.6姜黃素凝膠的體外透皮實驗將空白接收液超聲脫氣后轉移至Franz垂直擴散池的接收池中。取離體裸小鼠皮膚至生理鹽水中沖洗并解凍，裁剪成適當大小，固定于Franz垂直擴散池的擴散界面，角質(zhì)層面向供給池，真皮層面向接收池，分別將0.5 g的各處方姜黃素凝膠(表2)涂布于離體裸鼠皮膚的角質(zhì)層，水浴溫度調(diào)至32 ℃，200 r/min條件下持續(xù)攪拌，分別于給藥后的2、4、6、8、10、12 h從接收池中移取0.1 ml，并補充等溫、等體積的空白接收液于接收池中。取各時間點待測接收液10 μl，加入90 μl空白接收液，將混合后的接收液渦旋混勻1 min，取30 μl該混合液加入5 μl和厚樸酚工作液(300 ng/ml)，渦旋1 min后，移取5 μl進樣HPLC-MS/MS定量分析。按公式Qn=(Cn×Vp+Cn-1×Vq+……+C1×Vq)/A，計算各取樣時間點的累計滲透量，其中Cn表示第n個取樣點接收液濃度，Vp表示接收池體積(4.2 ml)，Vq表示每次從接收池中取樣體積(0.1 ml)，A表示有效透析面積(0.85 cm2)，Qn表示第n個取樣點單位面積下的累計滲透量。

2結果

2.1姜黃素的分析結果姜黃素的色譜保留時間為2.08 min，和厚樸酚的色譜保留時間為3.51 min，兩者分離良好，無相互干擾，皮膚內(nèi)源性物質(zhì)及接收液中外源性物質(zhì)不干擾姜黃素及和厚樸酚的測定，接收液樣品中成分即為待測物姜黃素(見圖1)。對姜黃素和內(nèi)標和厚樸酚進行質(zhì)譜分析，可得兩者的母離子和碎片離子的質(zhì)譜圖，結果見圖2。姜黃素母離子的分子離子峰為367.1，碎片離子的分子離子峰為149.0，內(nèi)標和厚樸酚母離子的分子離子峰為265.1，碎片離子的分子離子峰為224.1。

圖1　姜黃素及和厚樸酚的HPLC譜圖 Figure 1　HPLC photograms of curcumin and honokiol A：50 ng/ml的姜黃素標準液；B：300 ng/ml的和厚樸酚 工作液；C：姜黃素凝膠體外透皮實驗中接收液樣品； 1：姜黃素；2：和厚樸酚

表3　姜黃素質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間精密度和準確度

2.3不同促透劑對姜黃素的促透作用用Graphpad Prism 6 軟件處理不同取樣時間點下單位面積的累計滲透量，計算各處方的體外滲透參數(shù)，結果見表4。表4中，與對照組(處方7)相比，6種促透劑均顯示出對姜黃素的促透作用，其中月桂氮酮對姜黃素具有明顯的促透作用，其單位面積下12 h累計滲透量為(36.32±1.20) μg/cm2，滲透速率為(3.78±2.04) μg·cm-2·h-1。6種促透劑對姜黃素的促透作用依次為月桂氮酮>N-甲基-2-吡咯烷酮>油酸>丙二醇>薄荷腦>卵磷脂。

表4　不同處方姜黃素凝膠的體外滲透參數(shù)

3討論

通常體外透皮實驗的定量分析采用HPLC儀或紫外分光光度計，本研究結合已有文獻報道[5,6]和研究條件建立了姜黃素的HPLC-MS/MS分析方法。該方法在文獻報道的基礎上，將色譜的梯度洗脫優(yōu)化為等度洗脫，縮短了單個樣品的分析時間，另一方面在保證色譜柱的柱壓不超過最大壓力的同時縮短樣品的分析時間，將流動相的流速優(yōu)化為0.3 ml/min。在質(zhì)譜方面，本研究在確定姜黃素母離子和碎片離子的m/z后，分別對碰撞能量和裂解能量進行優(yōu)化，以獲得最佳的MRM參數(shù)。和已有方法相比，該分析方法靈敏度高、特異性好、色譜基線平穩(wěn)，姜黃素和內(nèi)標出峰良好，響應值高，樣品的分析時間短。

圖2　姜黃素及和厚樸酚的質(zhì)譜圖 Figure 2　Mass spectra photograms of curcumin and honokiol A：姜黃素的一級質(zhì)譜圖；B：姜黃素的二級質(zhì)譜圖；C：和厚樸酚的一級質(zhì)譜圖；D：和厚樸酚的二級質(zhì)譜圖

在體外經(jīng)皮滲透的研究中，6種促透劑對姜黃素分別具有不同的促透效果，促透劑的促透效果與其作用機制密切相關。月桂氮酮和N-甲基-2-吡咯烷酮同屬于氮酮類化合物，該類化合物可使細胞間脂質(zhì)排列有序性下降，擴大角質(zhì)層中的細胞間空隙，提高細胞間隙藥物的通過量。油酸對藥物的增溶作用是其主要的促透機制。丙二醇作為醇類化合物能溶脹和提取角質(zhì)層中的類脂，增加藥物的溶解度，從而提高極性和非極性藥物的經(jīng)皮吸收。薄荷腦的主要成分是一些萜烯類化合物，這些物質(zhì)可以通過刺激皮下毛細血管的血液循環(huán)提高藥物的經(jīng)皮吸收。卵磷脂作為表面活性劑自身可以滲入皮膚，并與皮膚成分相互作用，改變其滲透性質(zhì)。

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[修回日期]2015-09-14

[本文編輯]吳銘權