宋麗軍 侯旭杰 李雅雯 張 麗（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 8400；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 8400；.南疆食品檢驗(yàn)所，新疆 阿拉爾 8400）

核桃青皮，又稱青龍衣，是核桃加工過程中的副產(chǎn)物，據(jù)統(tǒng)計(jì)［1］，截止2010年底，新疆核桃青皮產(chǎn)量已達(dá)到13.41萬t。核桃青皮中含有豐富的多酚類化合物，如綠原酸、香草酸、槲皮素、沒食子酸、核桃酮等［2－4］，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，有抗衰老、治療心腦血管疾病、降血脂、抗癌、抗輻射等生理功能［1，5］。但長(zhǎng)期以來，核桃青皮均作為廢渣拋棄，造成了極大的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。

趙國建等［6］分別比較了溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、六偏磷酸鈉（SHMP）輔助提取法對(duì)核桃青皮多酚的提取效果，其中SHMP輔助提取法效果最佳，多酚得率為4.01mg/g，且需在70℃繼續(xù)提取120min；房祥軍等［7］采用50%丙酮—水溶液提取多酚得率為4.71%，但需連續(xù)提取3次，總提取時(shí)間達(dá)到4.5h。傳統(tǒng)的提取方法普遍存在提取時(shí)間長(zhǎng)、溫度高、提取效率低等缺點(diǎn)。

超高壓處理可以破壞物料的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞內(nèi)容物和提取溶劑充分接觸，加快提取速度，具有提取率高、提取溫度低，以及可避免熱效應(yīng)引起的有效成分損失和生理活性降低等優(yōu)點(diǎn)［8］。近年來，超高壓提取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于皂苷［8］、多糖［9］、茶多酚［10］、齊墩果酸［11］、茶樹花精油［12］等生物活性成分的提取研究中，并取得了良好的效果，但有關(guān)核桃青皮多酚的超高壓提取研究卻未見報(bào)道。本研究擬采用超高壓技術(shù)提取核桃青皮中的多酚類物質(zhì)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化多酚提取工藝，為核桃青皮多酚類物質(zhì)提取提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

核桃青皮：新疆薄皮核桃溫185核桃青皮，樹齡21～23年，2012年10月2日購于新疆阿拉爾市。由于不同品種、生長(zhǎng)期的核桃中多酚含量差異較大，本試驗(yàn)原料一次性采集。

福林—酚試劑、沒食子酸：美國Sigma公司。

乙醇、無水碳酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

減壓干燥箱：DHG－9101－1S型，上海鴻都電子科技有限公司；

恒溫水浴鍋：HH－S6型，上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

粉碎機(jī)：FZ102型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：Neofuge 15R型，北京陽光思特生物技術(shù)有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV－Mini1240型，日本島津公司；

電子天平：MA110型，上海臺(tái)衡儀器儀表有限公司；

超高壓處理裝置（圖1）：HPP.L.2－600/0.6型，工作壓力0～600MPa，工作溫度－10～60℃，傳壓介質(zhì)為水，天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司。

圖1 超高壓提取多酚示意圖Figure 1 The schematic diagram of extra－h(huán)igh pressure extraction

1.2 方法

1.2.1 提取工藝

核桃青皮→預(yù)處理→減壓干燥→粉碎、過篩→樣品、溶劑混合→真空包裝→預(yù)熱、超高壓處理（間歇加壓提取兩次）→離心→上清液→測(cè)定總多酚

操作要點(diǎn)：核桃青皮切分后于50℃減壓干燥，粉碎，過80目篩，置于棕色瓶中密封，－18℃冷凍保藏備用。取5g粉末與50%乙醇—水混合，避光、真空包裝，預(yù)熱3min后采用超高壓提取2次，兩次加壓間隔時(shí)間3min（包含升降壓時(shí)間），離心后取上清液，測(cè)定總多酚含量。

1.2.2 多酚類定性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［5］。

1.2.3 總多酚測(cè)定 采用福林—酚法［6］。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝0.102 8x－0.008 4（R2＝0.998 6）。樣品中的多酚以沒食子酸的含量表示，單位為mg/g。多酚得率按式（1）計(jì)算：

式中：

R——多酚得率，mg/g；

m1——核桃青皮質(zhì)量，g（干基）；

m2——核桃青皮提取液中多酚含量，mg（干基）。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）壓力對(duì)多酚提取效果的影響：以50%的乙醇—水為提取溶劑，在保壓時(shí)間5min、液料比30∶1（V∶m）、提取溫度40℃條件下，分別設(shè)置提取壓力100～600MPa，研究提取壓力對(duì)多酚提取效果的影響。

（2）溫度對(duì)多酚提取效果的影響：以50%的乙醇—水為提取溶劑，在提取壓力300MPa、保壓時(shí)間5min、液料比30∶1（V∶m）條件下，分別設(shè)置提取溫度20～60℃，研究提取溫度對(duì)多酚提取效果的影響。

（3）時(shí)間對(duì)多酚提取效果的影響：以50%的乙醇—水為提取溶劑，在提取壓力300MPa、液料比30∶1（V∶m）、提取溫度40℃條件下，分別設(shè)置提取時(shí)間2～7min，研究提取時(shí)間對(duì)多酚提取效果的影響。

（4）液料比對(duì)多酚提取效果的影響：以50%的乙醇—水為提取溶劑，在提取壓力300MPa、提取溫度40℃、提取時(shí)間5min條件下，分別設(shè)置液料比10∶1～60∶1（V∶m），研究液料比對(duì)多酚提取效果的影響。

以上試驗(yàn)均做3個(gè)平行，取平均值。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)核桃青皮多酚影響顯著的因素，運(yùn)用Design Expert 8.05軟件，根據(jù)Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以多酚得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，優(yōu)化核桃青皮多酚提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 核桃青皮多酚提取液定性試驗(yàn) 由表1可知：定性試驗(yàn)均顯示陽性結(jié)果，說明核桃青皮提取物中含有多酚類物質(zhì)。

表1 核桃青皮提取液多酚類定性試驗(yàn)Table 1 Qualitative test of polyphenols extracted from walnut green peel

2.1.2 提取溫度對(duì)多酚得率的影響 由于高溫極易造成多酚類物質(zhì)的損失，故本試驗(yàn)設(shè)定提取溫度低于60℃。由圖2可知，在超高壓條件下，溫度對(duì)多酚得率有顯著影響。20℃時(shí)多酚得率為6.454mg/g，40℃時(shí)多酚得率為6.875mg/g，增幅為0.420mg/g。當(dāng)溫度大于40℃時(shí)，多酚得率增幅不顯著。因此，后續(xù)試驗(yàn)提取溫度選擇40℃。

圖2 提取溫度對(duì)核桃青皮多酚得率的影響Figure 2 Effect of temperature on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.3 提取壓力對(duì)核桃青皮多酚得率的影響 由圖3可知，當(dāng)壓力小于300MPa時(shí)，隨著壓力的增大，多酚得率迅速增加，增幅達(dá)到1.895mg/g；當(dāng)壓力大于300MPa時(shí)，隨著壓力的增加，多酚得率小幅度增加，增幅為0.210mg/g。本試驗(yàn)采用二次加壓提取法，在升壓和卸壓過程中，對(duì)物料細(xì)胞造成極大的壓力差，使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜透通性發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)容物紊亂、外泄，增大了提取溶劑與有效成分的接觸面積，降低了傳質(zhì)阻力，從而使其傳質(zhì)速率加快［8］，提高得率?？紤]設(shè)備成本及效率，確定后續(xù)試驗(yàn)提取壓力為300MPa。

圖3 提取壓力對(duì)核桃青皮多酚得率的影響Figure 3 Effect of pressure on the extraction efficiency of polyphenols

圖4 提取時(shí)間對(duì)核桃青皮多酚得率的影響Figure 4 Effect of time on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響 由圖4可知，提取時(shí)間對(duì)核桃青皮多酚得率有顯著影響。當(dāng)保壓時(shí)間小于5min時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚得率顯著增加，增幅達(dá)到1.883mg/g；當(dāng)時(shí)間為5～8min時(shí)，多酚得率緩慢增加，增幅只有0.286mg/g?？赡苁窃诟邏簵l件下，物料細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生劇烈的渦流擴(kuò)散，有效成分傳質(zhì)速率快，因此在較短時(shí)間內(nèi)（5min）便可使細(xì)胞內(nèi)部和外部的多酚濃度達(dá)到平衡；之后再延長(zhǎng)保壓時(shí)間，多酚也無法由細(xì)胞內(nèi)部向提取溶液中擴(kuò)散［8］。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇保壓時(shí)間為5min。

2.1.5 液料比對(duì)多酚得率的影響 多酚類化合物的提取過程由滲透、溶解、擴(kuò)散幾個(gè)步驟組成，其中擴(kuò)散為最主要的作用。提取過程中，溶劑與原料的比值越大，則濃度梯度越大，多酚的擴(kuò)散速率越大［13］。由圖5可知：在液料比10∶1～30∶1（V∶m）范圍內(nèi)，隨著溶劑量的增加，多酚得率由3.942mg/g增加到6.873mg/g，增幅達(dá)到2.991mg/g；當(dāng)液料比大于30∶1（V∶m）時(shí)，增幅變緩，尤其是液料比大于40∶1（V∶m）時(shí)，多酚得率基本趨于穩(wěn)定?？紤]到液料比過大，不僅會(huì)消耗大量的溶劑，而且會(huì)降低提取液中有效成分的濃度，給后續(xù)分離純化過程帶來困難［10］。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇液料比1∶30（m∶V）。

圖5 液料比對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響Figure 5 Effect of liquid ratio on the extraction efficiency of polyphenols

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取溫度、壓力、時(shí)間、液料比4個(gè)因素，運(yùn)用 Design Expert 8.05軟件的Box－Behnken原理進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。各因素及水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Levels and codes of variables chosen for design

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The experimental and predicted values of polyphenols extraction

以多酚得率為響應(yīng)值（Y），利用Design Expert 8.05軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到響應(yīng)值對(duì)自變量的多元回歸方程（2）：

由表4可知：Fmodel＝49.61，P＜0.000 1，表明模型（2）極顯著，R2＝0.980 2，AdjR2＝0.960 5，Adeq Precision＝27.068，說明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，該模型可以用來分析和預(yù)測(cè)超高壓提取核桃青皮多酚的效果。

表4 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 4 Analysis of variance for quadratic regression equation

表4 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 4 Analysis of variance for quadratic regression equation

＊表示0.05水平顯著；＊＊ 表示0.01水平顯著。

變異來源 平方和 自由度 均方 F值 Pr＞F 顯著性模型 5.992 6 14 0.428 49.61 ＜0.000 1＊＊X10.029 2 1 0.029 2 3.385 0.087 1 X21.060 9 1 1.060 9 123.0 ＜0.000 1 ＊＊X30.933 5 1 0.933 5 108.2 ＜0.000 1 ＊＊X43.194 0 1 3.194 370.2 ＜0.000 1 ＊＊X1X20.000 3 1 0.000 3 0.033 0.857 4 X1X30.008 6 1 0.008 6 1.002 0.333 7 X1X40.018 0 1 0.018 2.081 0.171 1 X2X30.043 7 1 0.043 7 5.063 0.041 0 ＊X2X40.121 1 1 0.121 1 14.04 0.002 2 ＊X3X46E－05 1 6E－05 0.007 0.936 8 X21 0.159 3 1 0.159 3 18.46 0.000 7 ＊X22 0.138 2 1 0.138 2 16.02 0.001 3 ＊X23 0.087 4 1 0.087 4 10.13 0.006 6 ＊X24 0.453 2 1 0.453 2 52.53 ＜0.000 1 ＊＊?dú)埐?0.120 8 14 0.008 6失擬 0.111 6 10 0.011 2 4.855 0.070 7誤差 0.009 2 4 0.002 3總和6.113 3 28

模型（2）中一次項(xiàng) X2、X3和X4極顯著，交互項(xiàng) X2X3和X2X4顯著，、和顯著，極顯著，其它不顯著。對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，剔除不顯著交互項(xiàng)，得到核桃青皮多酚得率（mg/g）對(duì)各自變量的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程（3）：

根據(jù)一次項(xiàng)自變量系數(shù)可知，各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響大小順序?yàn)椋篨4（液料比）＞X2（壓力）＞X3（時(shí)間）＞X1（溫度）。

圖6、7為壓力和時(shí)間、壓力和液料比對(duì)核桃青皮多酚提取效果的影響，通過等高線及響應(yīng)面圖可直觀地反映出不同變量間交互作用的顯著程度，等高線越扁平說明因素之間交互作用越顯著，對(duì)多酚得率的影響越大。由圖6、7可知：壓力和時(shí)間交互作用、壓力和液料比交互作用的等高線均呈現(xiàn)橢圓、扁平狀，表示上述因素之間的相互作用顯著。

圖6 Y＝f（X2，X3）的響應(yīng)面和等高線圖Figure 6 Response surface and contours of Y＝f（X2，X3）

圖7 Y＝f（X2，X4）的響應(yīng)面和等高線圖Figure 7 Response surface and contours of Y＝f（X2，X4）

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)軟件和模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析，得到核桃青皮多酚超高壓提取的最佳工藝條件為：溫度42.19℃，壓力309.09MPa，時(shí)間6.00min，液料比39.69∶1（V∶m），在此條件下預(yù)測(cè)得率為7.35mg/g。結(jié)合實(shí)際操作情況，將上述最優(yōu)工藝調(diào)整為：溫度42℃，壓力310MPa，時(shí)間6min，液料比40∶1（V∶m）。在此優(yōu)化工藝條件下，3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的多酚得率分別為7.31，7.45，7.49mg/g，平均值為7.417mg/g，驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差相差較小，說明了模型的有效性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了超高壓提取核桃青皮多酚的最佳工藝為：采用超高壓二次提取法，以50%乙醇—水為提取液，粉碎粒度80目，溫度42℃，壓力310MPa，時(shí)間6min，液料比40∶1（V∶m），此條件下多酚得率為7.417mg/g。本研究的不足之處在于未對(duì)超高壓條件下多酚類物質(zhì)的傳質(zhì)機(jī)理及其動(dòng)力學(xué)進(jìn)行深入研究，下一步需針對(duì)上述問題進(jìn)行深入探討。

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