朱向榮 李高陽 蘇東林 劉 偉 單 楊（1.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省食品測試分析中心，湖南 長沙 410125）

鎘（cadmium，Cd）是一種毒性大，遷移性強(qiáng)的重金屬元素，Cd在土壤中有較高活性［1］，Cd污染是土壤和食品中重金屬污染關(guān)注的首要問題之一。水稻被認(rèn)為是鎘吸收最強(qiáng)的大宗谷類作物［2］，很容易吸收土壤中的鎘。水稻鎘污染不僅導(dǎo)致水稻產(chǎn)量下降，更為嚴(yán)重的是鎘元素在水稻植株內(nèi)大量累積，并通過食物鏈進(jìn)入人體，對人類健康帶來嚴(yán)重危害［3］。中國GB 2762—2012《食品中污染物限量》規(guī)定稻米中鎘的最高限量為0.2mg/kg，因此，對稻米中鎘含量進(jìn)行質(zhì)量控制，保障稻米食用安全，采用靈敏、準(zhǔn)確的分析方法檢測稻米鎘含量尤為重要。目前，國內(nèi)外研究者［4］常采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜與石墨爐原子吸收光譜法等儀器分析方法測定農(nóng)產(chǎn)品中Cd含量。上述方法雖然準(zhǔn)確性好，專屬性強(qiáng)、靈敏度高，但也存在著樣品消化時間長、強(qiáng)酸試劑消耗量大、環(huán)境危害較大、儀器操作復(fù)雜等缺點。

近紅外光譜法（near－infrared spectroscopy，NIRS）是目前發(fā)展較為迅速的分子光譜快速檢測技術(shù)，具有快速、無損、綠色、環(huán)境友好等優(yōu)點。NIRS在稻米中淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、礦質(zhì)元素、水分、脂肪酸值等營養(yǎng)指標(biāo)的含量檢測等領(lǐng)域均有應(yīng)用。從原理上講，無機(jī)元素在近紅外光譜區(qū)并沒有吸收，但是有機(jī)物質(zhì)通過螯合或絡(luò)合的方式與無機(jī)元素形成螯合物或絡(luò)合物，而這些物質(zhì)在近紅外光譜區(qū)有相應(yīng)的響應(yīng)與吸收［5］。稻米的主要有機(jī)成分為淀粉和蛋白質(zhì)，其含量分別約為80%和8%。鎘元素與淀粉及蛋白質(zhì)中的C—H、N—H與O—H等基團(tuán)結(jié)合，而使得采用近紅外光譜檢測鎘成為可能。近年來，國外學(xué)者采用NIRS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對動物樣 品［6，7］、植物樣品［8－11］以及 水樣［12，13］中重金屬元素定性、定量分析，Kumagai等［14］采用NIRS對鎘污染稻米進(jìn)行定性研究，但尚未見到采用NIRS對稻米鎘進(jìn)行定量研究的報道。本研究擬通過NIRS與組合間隔偏最小二乘法（synergy interval partial least squares，siPLS）組合，建立稻米鎘含量是否超標(biāo)的NIRS定量模型，并對光譜預(yù)處理方法與光譜變量篩選進(jìn)行系統(tǒng)的考察，以達(dá)到預(yù)期的效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

石墨爐原子吸收光譜儀：AA－6800型，日本島津公司；

傅里葉變換近紅外光譜儀：Nicolet AntarisⅡ型，美國Thermo公司；

硝酸、高氯酸：優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品收集 在湖南省長沙市周邊收集了72個稻米樣品（40個樣品采自湘陰縣浩河口鎮(zhèn)，10個樣品采自長沙縣大同橋鎮(zhèn)，12個樣品采自長沙縣江背鎮(zhèn)，10個樣品采自長沙縣干杉鎮(zhèn)）。樣品經(jīng)烘干（85℃，2h）、去殼、粉碎、過60目篩4個步驟。

1.2.2 鎘含量的測定 按 GB/T 5009.15—2003《食品中鎘的測定》執(zhí)行。

1.2.3 NIRS方法 利用積分球漫反射檢測系統(tǒng)完成樣品近紅外光譜的采集，NIRS掃描波數(shù)范圍4 000～10 000cm－1。NIRS方法經(jīng)優(yōu)化后，樣品光譜采集的工作流（workflow）確定為：分辨率8cm－1，掃描次數(shù)32次，增益為2，以內(nèi)置背景為參考。每個樣品重復(fù)3次掃描，取其平均光譜，以消除樣品不均勻性帶來的干擾。

1.2.4 組合間隔偏最小二乘法 偏最小二乘回歸法（partial least squares regression，PLSR）是多元校正中經(jīng)典的定量建模方法之一。在建模的過程中，為了不丟失光譜信息，PLSR常采用全光譜（full spectrum）數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，但是全光譜中無信息變量（uninformative variables）過多，將會導(dǎo)致模型過擬合，預(yù)測結(jié)果變差。因此，需采用變量篩選方法提取特征變量，提高NIRS模型的精度。間隔偏最小二乘法［15］（interval partial least square，iPLS）是將全光譜分為n個等寬子區(qū)間，然后對每個子區(qū)間進(jìn)行局部建模，得到誤差最小，相關(guān)系數(shù)最大的子區(qū)間。組合間隔偏最小二乘法（siPLS）是iPLS的一個擴(kuò)展，該方法的主要原理是以交叉驗證均方根誤差為指標(biāo)，對全光譜不同子區(qū)間（比如2、3以及4個區(qū)間）進(jìn)行任意組合，采用多元回歸方法建立定量模型，最終得到最優(yōu)的光譜變量區(qū)間組合以及相應(yīng)的模型［16］。

1.2.5 模型評價 采用模型相關(guān)系數(shù)（R）、交叉驗證均方根（RMSECV）與預(yù)測集驗證均方根（RMSEP）進(jìn)行評價，分別按式（1）～（3）計算：

式中：

ci——試驗值，mg/kg；

n——校正集樣本數(shù)；

m——預(yù)測集樣本數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計分析 利用MATLAB軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 校正集的選擇

采用NIRS數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，選擇有代表性的校正集樣品進(jìn)入到校正模型的數(shù)據(jù)庫，不但可以降低過擬合風(fēng)險、提高模型的預(yù)測精度，還可以減少建模的工作量。本研究共收集72個稻米樣本，采用基于馬氏距離的Kennard－Stone（KS）法［17］依次從整個樣本集（samples set）挑選54個樣品作為校正集（calibration set），18個樣品作為預(yù)測集（prediction set）。

2.2 光譜分析

圖1為代表性樣品在4 000～10 000cm－1的NIRS圖，主要吸收峰光譜解析為［18］：8 423.5cm－1附近的吸收峰為C—H鍵振動的二級倍頻，6 907cm－1附近的吸收峰為O—H鍵伸縮振動的一級倍頻，6 480cm－1附近的吸收峰為N—H鍵伸縮振動的一級倍頻，5 720cm－1與5 900cm－1兩處吸收峰對應(yīng)的是C—H鍵的一級倍頻，5 200cm－1附近的吸收峰為O—H鍵振動組合頻，4 830cm－1附近的吸收峰為N—H鍵伸縮振動與彎曲振動的組合頻，4 390cm－1附近的吸收峰為C—H振動的組合頻。

圖1 稻米樣品代表性的近紅外光譜圖Figure 1 NIR spectrum of rice sample

2.3 光譜預(yù)處理比較

采集的NIRS中，光譜的背景噪聲、物理因素導(dǎo)致的光散射與量綱不一致等將對建模的準(zhǔn)確性產(chǎn)生重要影響［19］。因此，需要對光譜進(jìn)行預(yù)處理，以減少上述影響。在全光譜范圍內(nèi)，以RMSECV值及Rc（訓(xùn)練集相關(guān)系數(shù)）進(jìn)行評價指標(biāo)，考察了Savitzky－Golay（SG）平滑、中心化（meaning）、自歸一化（autoscaling）及多元散射校正（multiple scattering correction，MSC）等5種數(shù)據(jù)預(yù)處理方法對稻米樣品的NIR光譜模型的影響。最終確定了平滑、中心化以及多元散射校正作為光譜預(yù)處理最優(yōu)方法。

2.4 基于siPLS法的特征變量選擇

本研究采集的近紅外原始光譜包含1 557個變量，在多元變量校正時包含著不相關(guān)或冗余信息，利用全光譜建立校正模型存在著過擬合風(fēng)險。因此，采用特征變量選擇方法對全光譜變量進(jìn)行篩選，能減少模型的變量數(shù)，降低模型的復(fù)雜性，提高模型的預(yù)測性能。本試驗分析了siPLS特征變量提取方法，并與全光譜建模結(jié)果進(jìn)行比較。SiPLS法具體步驟：將全光譜劃分為60個區(qū)間，每個區(qū)間26個變量，然后對不同區(qū)間進(jìn)行組合，得到RMSECV值最小的子區(qū)間組合。本試驗考察了siPLS法不同子區(qū)間個數(shù)的組合對模型的影響，確定3個區(qū)間組合次數(shù)時，RMSECV值最低，Rc值最大。

圖2為訓(xùn)練集建模時前10個主因子數(shù)與所對應(yīng)的RMSECV值的相關(guān)圖。由圖2可知，當(dāng)主因子數(shù)為9時，RMSECV值最小。

圖2 主因子數(shù)與RMSECV的相關(guān)圖Figure 2 The correlation diagram of PLS components and RMSECV

表1列出了前10個區(qū)間組合所對應(yīng)的波數(shù)位置、主因子數(shù)以及RMSECV值，由表1可知，組合區(qū)間為［21 30 38］時，對應(yīng)的主因子數(shù)為9，此時RMSECV值最小，為0.247。

采用siPLS法得到的最優(yōu)區(qū)間組合為［21 30 38］，21，30與38三區(qū)間在全光譜對應(yīng)的波數(shù)位置見圖3，分別為6 005.2～6 101.6，6 907.8～7 004.2與7 710.0～7 806.4cm－1。具體NIRS解析為［18］：6 005.2～6 101.6cm－1為C—H伸縮振動的一級倍頻，6 907.8～7 004.2cm－1為蛋白質(zhì)N—H反對稱伸縮振動一級倍頻以及淀粉O—H伸縮振動的一級倍頻。7 710.0～7 806.4cm－1為C—H伸縮振動的一級倍頻伸縮振動的第二組合頻。

表1 RMSECV最低的前10個組合區(qū)間及其對應(yīng)的主因子數(shù)Table 1 The top 10intervals corresponding to PLS component and RMSECV using siPLS

圖3 采用siPLS算法選擇波段在全譜中的位置Figure 3 Spectral subintervals were selected by siPLS algorithm

采用siPLS法選擇NIRS特征吸收波數(shù)，建立稻米鎘PLS定量模型并進(jìn)行預(yù)測，訓(xùn)練集中54個樣品ICP—MS測定的試驗值與NIRS預(yù)測值的相關(guān)圖見圖4。由圖4可知，樣本號為8＃、30＃與31＃的樣品預(yù)測相對較差。此時，模型校正集 RMSECV為0.247，訓(xùn)練集相關(guān)系數(shù)（Rc）為0.919。

圖5為預(yù)測集中18個樣品ICP—MS測定的試驗值與NIRS預(yù)測值的相關(guān)圖。預(yù)測集RMSECV為0.261，預(yù)測集相關(guān)系數(shù)（Rp）為0.895。

圖4 訓(xùn)練集中試驗值與預(yù)測值的相關(guān)圖Figure 4 Prediction value vs.ICP—MS measurement for the determination of actual content in the calibration set（n＝54）

圖5 預(yù)測集中試驗值與預(yù)測值的相關(guān)圖Figure 5 Prediction value vs.ICP—MS measurement for the determination of actual content in the calibration set（n＝18）

2.5 全譜和特征波長選擇模型的比較

為了評價siPLS法在稻米鎘定量建模變量選擇中的重要性，本研究采用2.3節(jié)相同的光譜預(yù)處理手段，建立了全光譜的PLS模型。由表2可知，采用全光譜建立的PLS模型的預(yù)測結(jié)果比siPLS法都要差，這說明采用siPLS法對原始光譜進(jìn)行特征波長選擇，主要成分信息得到最大保留，冗余信息得到部分去除，預(yù)測能力得到提高。

表2 siPLS法與PLS建模結(jié)果比較Table 2 Comparison of the results of siPLS and PLS

3 結(jié)論

本研究采用近紅外光譜與組合間隔偏最小二乘法相結(jié)合，初步實現(xiàn)了鎘污染稻米中鎘含量的定量檢測。結(jié)果表明，采用siPLS法選擇特征變量再進(jìn)行建模，所得結(jié)果優(yōu)于全譜建模結(jié)果。本研究將進(jìn)一步擴(kuò)大樣品量，提高模型的穩(wěn)健性與準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果可為近紅外光譜技術(shù)在稻米鎘快速識別上提供初步依據(jù)。

1 Chaney R L，Reeves P G，Ryan J A，et al.Improved understanding of hyperaccumulation yields commercial phytoextraction and phytomining technologies［J］.Biometals，2004，17（5）：549～553.

2 Lindén A，Olsson I M，Bensryd I，et al.Monitoring of cadmium in the chain from soil via crops and feed to pig blood and kidney［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2003，55（2）：213～222.

3 Chen Gui－ping，Mei Yuan，Tao Wei，et al.Micro near infrared spectroscopy（MicroNIRS）based on on－line enrichment：determination of trace copper in water using glycidyl methacrylatebased monolithic material［J］.Analytica Chimica Acta，2011，670（1～2）：39～43.

4 Akamatsu S，Yoshioka N，Mitsuhashi T.Sensitive determination of cadmium in brown rice and spinach by flame atomic absorption spectrometry with solid－phase extraction［J］.Food Additives ＆Contaminants：Part A，2012，29（11）：1 696～1 700.

5 Kumagai M，Ohisa N，Amano T，et al.Canonical discriminant analysis of cadmium content levels in unpolished rice using aportable near－infrared spectrometer［J］.Analytical Science，2003，19（11）：1 553～1 555.

6 González－Martín I，González－Pérez C，Hernández－Méndez J，et al.Mineral analysis（Fe，Zn，Ca，Na，K）of fresh Iberian pork loin by near infrared reflectance spectrometry：Determination of Fe，Na and K with a remote fibre－optic reflectance probe［J］.Analytica Chimica Acta，2002，468（2）：293～301.

7 Font R，Del Río－Celestino M，Vélez D，et al.Visible and nearinfrared spectroscopy as a technique for screening the inorganic arsenic content in the red crayfish（procambarus clarkii Girard）［J］.Analytical Chemstry，2004，76（14）：3 893～3 898.

8 Font R，Del Río－Celestino M，Vélez D，et al.Use of near－infrared spectroscopy for determining the total arsenic content in prostrate amaranth［J］.Science of the Total Environment，2004，327（1～3）：93～104.

9 Font R，Vélez D，Del Río－Celestino M，et al.Screening inorganic arsenic in rice by visible and near－infrared spectroscopy［J］.Microchimica Acta，2005，151（3～4）：231～239.

10 張龍，潘家榮，朱誠.基于近紅外光譜的重金屬汞、鎘和鉛污染水稻葉片鑒別［J］.浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2013，39（1）：50～55.

11 劉燕德，施宇.香根草葉片鉛含量近紅外光譜快速檢測［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報，2014，45（3）：232～236.

12 Ning Yu，Li Ji－h(huán)ui，Cai Wen－sheng，et al.Simultaneous determination of heavy metal ions in water using near－infrared spectroscopy with preconcentration by nano－h(huán)ydroxyapatite［J］.Spectrochimica Acta Part A：Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2012（96）：289～294.

13 Huang Zi－xia，Tao Wei，F(xiàn)ang Juan－juan，et al.Multivariate calibration of on－line enrichment near－infrared （NIR）spectra and determination of trace lead in water［J］.Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems，2009，98（2）：195～200.

14 Kumagai M，Ohisa N，Amano T，et al.Canonical discriminant analysis of cadmium content levels in unpolished rice using a portable near－infrared spectrometer［J］.Analytical Sciences，2003，19（11）：1 553～1 555.

15 Norgaard L，Saudland A，Wagner J，et al.Interval partial least squares regression （iPLS）：a comparative chemometric study with an example from near－infrared spectroscopy［J］.Applied Spectroscopy，2000，54（3）：413～419.

16 丁姣，蔡建榮，張海東，等.近紅外結(jié)合Si－ELM檢測食醋品質(zhì)指標(biāo)［J］.食品與機(jī)械，2012，28（1）：93～96.

17 Kennard R W，Stone L A.Computer aided design of experiments［J］.Technometrics，1969（11）：137～148.

18 陸婉珍.現(xiàn)代近紅外光譜分析技術(shù)［M］.第二版.北京：中國石化出版社，2006.

19 張菊華，朱向榮，蘇東林，等.茶油品質(zhì)鑒別的透射和透反射模式分析比較［J］.食品與機(jī)械，2012，28（1）：101～104.