王 雨 單 楊 李高陽

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省農(nóng)科院，湖南 長沙 410125；3.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125）

野桂花蜜中的酚類化合物是一種天然的抗氧化劑［1］。天然抗氧化劑具有無毒害的特點(diǎn)，可以有效地抑制人體內(nèi)的自由基［2－5］。目前對蜂蜜多酚的提取多采用傳統(tǒng)的浸提法或是直接粗略萃取后進(jìn)行純化，存在提取時(shí)間長、提取率低的問題。

超聲波輔助提取法由于操作簡便，提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中有效成分的提?。?－8］。超聲波能產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，可以高效地提取天然活性成分［9］。本研究擬以野桂花蜜為原料，采用超聲波輔助提取野桂花蜜中的多酚化合物，再用響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝參數(shù)，從而為獲得更高得率的多酚化合物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野桂花蜜：產(chǎn)自洞庭湖畔，低溫保存，湖南省明園蜂業(yè)有限公司；

Folin－酚試劑：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；

乙酸乙酯、鹽酸、碳酸鈉：分析純，上海試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：AUW220D型，日本島津有限公司；

超聲波清洗器：KQ－500DTV型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外－可見分光光度計(jì)：UV－1700型，日本島津有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EV311型，上海垣欽自動(dòng)化科技有限公司；

循環(huán)水真空泵：SHZ－III型，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 配制濃度為0.1mg/mL的原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于10mL的容量瓶中，加入福林—酚試劑1mL，用玻璃棒攪勻，然后加入1mol/L的碳酸鈉溶液5mL，定容搖勻，常溫下避光靜置1h，于765nm處測吸光度。以原兒茶酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到的回歸方程為y＝150.71x＋0.004 3（R2＝0.999 8）。

1.3.2 野桂花蜜多酚化合物的超聲波輔助提取 準(zhǔn)確稱量10.0g野桂花蜜于50mL的錐形瓶中，將一定溶劑濃度的乙酸乙酯溶液，按照不同料液比加入錐形瓶中，磁力攪拌1min后，將錐形瓶置于超聲波發(fā)生器中一定溫度下提取一段時(shí)間后，趁熱分離合并上清液。然后真空濃縮至膏狀物，用4mL乙醇溶解，在765nm下測定吸光度。

1.3.3 多酚化合物得率的測定 多酚化合物得率按式（1）計(jì)算：

式中：

Y——多酚得率，mg/10g；

C——測得的多酚濃度，mg/mL；

V——乙醇溶液體積，mL；

M0——原料的質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）溶劑濃度對多酚得率的影響：固定料液比為1︰10（m︰V），超聲波時(shí)間為20min，超聲波溫度為50℃，考察不同溶劑濃 度（30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%）對野桂花蜜多酚得率的影響。

（2）料液比對多酚得率的影響：固定溶劑濃度為60%，超聲波時(shí)間為20min，超聲波溫度為50℃，考察不同料液比（1︰4，1︰6，1︰8，1︰10，1︰12，1︰14，m︰V）對野桂花蜜多酚得率的影響。

（3）超聲波時(shí)間對多酚得率的影響：固定溶劑濃度為60%，料液比為1︰10（m︰V），超聲波溫度為50℃，考察不同超聲波時(shí)間（10，15，20，25，30min）內(nèi)野桂花蜜多酚得率的變化規(guī)律。

（4）超聲波溫度對多酚得率的影響：固定溶劑濃度為60%，料液比為1︰10（m︰V），超聲波時(shí)間為20min，考察不同超聲波溫度（30，40，50，60，70℃）對野桂花蜜多酚得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以野桂花蜜多酚提取得率為響應(yīng)值，選取溶劑濃度、料液比、超聲波時(shí)間、超聲波溫度4個(gè)影響因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 溶劑濃度對多酚得率的影響Figure 1 Effect of concentration of solvent on yield of phenolic

2.1.1 溶劑濃度對野桂花蜜多酚得率的影響 由圖1可知，溶劑濃度在60%以前，野桂花蜜多酚的得率隨著溶劑濃度的增高而增多。當(dāng)溶劑濃度到達(dá)60%之后，野桂花蜜多酚的得率呈現(xiàn)緩慢的下降趨勢。溶劑濃度到達(dá)90%時(shí)，野桂花蜜多酚的得率降低至56.80mg/10g。這是因?yàn)殚_始時(shí)隨著溶劑濃度的增高，野桂花蜜中多酚化合物與提取溶液的接觸機(jī)會(huì)越來越多。當(dāng)濃度到達(dá)60%之后，水分占比減少，野桂花蜜中的大分子糖類由于極性差異不能溶出，使得提取時(shí)有結(jié)晶未溶的現(xiàn)象。這使得其中的多酚沒能充分溶解出來，提取量反而減少。所以，選擇最佳的溶劑濃度為60%。

2.1.2 料液比對野桂花蜜多酚得率的影響 由圖2可知，隨著料液比的減少，野桂花蜜多酚的得率逐漸升高，當(dāng)料液比達(dá)到1︰10（m︰V）時(shí)，野桂花蜜多酚的得率不再上升。其原因是隨著溶劑的增加，多酚化合物更易接觸到提取溶劑，多酚得率也就越大。當(dāng)料液比達(dá)到1︰10（m︰V）時(shí)，多酚化合物已基本被提取出來，繼續(xù)加入溶劑，起不到提高提取率的作用，高用量的溶劑反而不適于提取，同時(shí)，出于節(jié)約成本考慮，料液比選擇1︰10（m︰V）為宜。

2.1.3 超聲波時(shí)間對野桂花蜜多酚的影響 由圖3可知，在20min內(nèi)，野桂花蜜多酚得率隨超聲波時(shí)間的增加而增加，20min后，野桂花蜜多酚得率隨超聲波時(shí)間的增加反而出現(xiàn)下降。0～20min的過程中，由于超聲波的空化作用，其提取速度得到提升，野桂花蜜多酚得率提升顯著［10］。在20 min后，多酚化合物基本被提取出來，同時(shí)，由于過長的超聲波作用，使得多酚化合物中一些不穩(wěn)定的成分被破環(huán)［11］，所以出現(xiàn)了下降。故確定提取過程的最佳超聲波時(shí)間為20 min。

圖2 料液比對多酚得率的影響Figure 2 Effect of rate of solid to solution on yield of phenolic

圖3 超聲波時(shí)間對多酚得率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic time on yield of phenolic

2.1.4 超聲波溫度對野桂花蜜多酚的影響 由圖4可知，在溫度低于50℃時(shí)，隨著溫度的升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，使得多酚化合物的得率迅速提升，在50℃繼續(xù)往上升溫時(shí)，發(fā)現(xiàn)野桂花蜜多酚的得率隨溫度的上升有明顯的下降。原因可能是多酚化合物中的熱不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)在高溫作用下被破壞［12］。而且過高的溫度會(huì)促進(jìn)水分和乙酸乙酯的揮發(fā)，從而影響多酚得率。故選擇最佳提取溫度為50℃。

圖4 超聲波溫度對多酚得率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic temperature on yield of phenolic

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［13］，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案見表1，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of respnse suirface analysis

表2 Box－Behnken設(shè)計(jì)方案及野桂花蜜多酚得率的測定結(jié)果Table 2 Box－Behnken matrix and respenses values of phenolic compounds yield

通過Design Expert V8.0.6軟件對表2中的野桂花蜜多酚得率進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到回歸方程：

對回歸方程進(jìn)行方差分析（見表3），此回歸模型顯著（P＜0.000 1），而且上述回歸方程的決定系數(shù)R2＝0.969 5，＝0.939 1，說明96.95%的數(shù)據(jù)可以用此方程模型解釋，模型可以真實(shí)地反應(yīng)各個(gè)因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。與此同時(shí)，失擬項(xiàng)P值為0.072 6＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著說明此回歸方程擬合度很好，試驗(yàn)誤差小。因此可以用該回歸方程分析和預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。由表3可知，一次項(xiàng)X1、X3和X4均達(dá)到極顯著水平，X2不顯著，而二次項(xiàng)的影響均為顯著，說明各因素對野桂花蜜多酚的影響并非簡單的線性關(guān)系。

表3 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis for the experiment result

表3 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis for the experiment result

＊＊.P＜0.01，差異極顯著；＊.P＜0.05，差異顯著；R2＝0.969 5；＝0.939 1。

來源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 顯著性X1 278.40 1 278.40 53.10 ＜0.000 1＊＊X2 21.87 1 21.87 4.17 0.060 4 X3 62.42 1 62.42 11.90 0.003 9 ＊＊X4 384.54 1 384.54 73.35 ＜0.000 1 ＊＊X1X2 34.86 1 34.86 6.65 0.021 8 ＊X1X3 60.21 1 60.21 11.48 0.004 4 ＊＊X1X4 2.32 1 2.32 0.44 0.516 2 X2X3 47.19 1 47.19 9.01 0.009 5 ＊＊X2X4 19.49 1 19.49 3.71 0.074 3 X3X4 8.73 1 8.73 1.66 0.217 7 X12 1 017.19 1 1 017.19 194.04 ＜0.000 1 ＊＊X22 267.98 1 267.98 51.12 ＜0.000 1 ＊＊X32 372.09 1 372.09 70.98 ＜0.000 1 ＊＊X42 434.17 1 434.17 82.82 ＜0.000 1 ＊＊模型 2 336.58 14 166.90 31.84 ＜0.000 1 ＊＊失擬值 67.72 10 6.77 4.78 0.072 6純誤差 5.67 4 1.42總和2 409.97 28

2.2.2 響應(yīng)面分析 通過回歸方程，固定其中一個(gè)因素在0水平，可以得到另兩個(gè)因素之間的交互作用的響應(yīng)面圖（見圖5）。從圖5中可直觀地看出響應(yīng)面的優(yōu)化區(qū)域和各個(gè)因素對野桂花蜜多酚得率的影響程度。結(jié)合回歸方程以及表3的數(shù)據(jù)可知：超聲波溫度對多酚得率的影響最為顯著，響應(yīng)值變化最大，同時(shí)曲線較陡。而料液比對多酚得率的影響最小，響應(yīng)值變化較小，同時(shí)曲面比較平滑。綜合后可以得出對野桂花蜜多酚得率的影響程度從大到小的順序依次為超聲波溫度＞溶劑濃度＞超聲波時(shí)間＞料液比。

2.2.3 最佳工藝條件的驗(yàn)證 通過 Design Expert V8.0.6軟件對響應(yīng)值（多酚的得率）進(jìn)行優(yōu)化分析，得到最佳提取條件為 X1（62.45）、X2（1∶9.94）、X3（21.22）、X4（53.75），即溶劑濃度62.45%，料液比1︰9.94（m︰V），超聲波時(shí)間21.22min，超聲波溫度53.75℃，野桂花蜜多酚得率的理論值為68.952mg/10g。為方便實(shí)際操作，取溶劑濃度62%，料液比1︰10（m︰V），超聲波時(shí)間21min，超聲波溫度54℃，對提取野桂花蜜多酚工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n＝3），得到野桂花蜜多酚的平均得率為68.27mg/10g，達(dá)到了理論值的99%，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝得到的條件參數(shù)可靠。2.2.4 超聲波輔助提取法與傳統(tǒng)浸提法的比較 由表4可知，傳統(tǒng)浸提法得到的野桂花蜜多酚的平均得率僅為52.48mg/10g。而超聲波輔助提取法提取野桂花蜜多酚的得率比傳統(tǒng)浸提法得率高出23%，而且大大節(jié)省了提取時(shí)間。

圖5 各因素交互作用對野桂花蜜多酚得率影響的響應(yīng)面圖Figure 5 Response surface plots for extraction yield of phenolic compounds from wild osmanthus－scented honey in function of the factors

表4 提取方法對野桂花蜜得率的影響Table 4 The effects different extraction methods on the yield of wild osmanthus－scented honey（n＝3）

3 結(jié)論

通過Design Expert V8.0.6軟件，以溶劑濃度、料液比、超聲波時(shí)間、超聲波溫度為自變量，野桂花蜜多酚的得率為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面分析法對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到的回歸模型擬合度好，誤差小，能夠用回歸模型對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，有一定的應(yīng)用價(jià)值。優(yōu)化驗(yàn)證后得到的野桂花蜜多酚提取工藝條件為：溶劑濃度62%，料液比1︰10（m︰V），超聲波時(shí)間21min，超聲波溫度54℃。野桂花蜜多酚的得率為68.27mg/10g。超聲波輔助提取法比傳統(tǒng)浸提法的多酚得率高出23%。野桂花蜜中的多酚化合物的得率，可能會(huì)受蜜源地環(huán)境影響，如氣候和蜜源植物本身狀況等，因此有待進(jìn)行深入研究。

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