隋嘯一 高 琴 劉 磊 李福昌

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018）

蛋白質(zhì)是生命過(guò)程的重要物質(zhì)，是組成機(jī)體結(jié)構(gòu)物質(zhì)、體內(nèi)代謝活性物質(zhì)的主要成分，是組織更新、修補(bǔ)的原料。哺乳動(dòng)物必須每天攝取一定量的蛋白質(zhì)來(lái)滿(mǎn)足機(jī)體需求。飼糧中蛋白質(zhì)水平的變化能夠影響動(dòng)物的食欲，從而影響到動(dòng)物的生產(chǎn)性能。動(dòng)物的食欲調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，下丘腦是食欲調(diào)節(jié)的中樞，其最主要的食欲調(diào)控位點(diǎn)是弓形核（ARC）［1－2］，這里包含2類(lèi)相互聯(lián)系的調(diào)控神經(jīng)元：促進(jìn)采食的神經(jīng)肽Y（NPY）、刺鼠基因相關(guān)蛋白（AgRP）和抑制采食的阿片促黑色素原（POMC）、可卡因－苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄 物 （CART）［3］。NPY／AgRP 和 POMC／CART這2類(lèi)神經(jīng)元是食欲調(diào)控的1級(jí)神經(jīng)元［4］。NPY、AgRP、POMC和CART基因在各物種之間的進(jìn)化上是保守的，在哺乳動(dòng)物和家禽中，NPY、AgRP都具有刺激食欲、促使動(dòng)物攝食的作用，而POMC、CART具有使動(dòng)物產(chǎn)生厭食感、停止攝食的作用。此外，AgRP與POMC競(jìng)爭(zhēng)其受體形成了黑皮質(zhì)素系統(tǒng)，形成一個(gè)食欲調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。外周食欲調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括胃腸道、脂肪、胰腺等，其中膽囊收縮素（CCK）是外周激素調(diào)節(jié)攝食的重要生理因子［5－6］。當(dāng)腸道上皮細(xì)胞感受到食物刺激時(shí)，通過(guò)釋放CCK來(lái)調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌的收縮或蠕動(dòng)、胃的排空以及對(duì)胃酸分泌。此外，CCK的釋放能夠刺激外周神經(jīng)，產(chǎn)生“飽感”信號(hào)，這些信號(hào)通過(guò)迷走神經(jīng)傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)［7］；CCK也可以直接通過(guò)血腦屏障，與下丘腦中受體結(jié)合，調(diào)節(jié)1級(jí)神經(jīng)元表達(dá)［8］。Fan等［9］發(fā)現(xiàn)，在小鼠的下丘腦中發(fā)現(xiàn)大量的CCK受體的存在，并且CCK可通過(guò)下丘腦中POMC神經(jīng)元調(diào)節(jié)食欲。最終，下丘腦對(duì)外周信號(hào)進(jìn)行綜合，最后決定是否終止攝食。

在小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中蛋白質(zhì)水平的變化是影響腸道內(nèi)CCK釋放的主要因素［10］。此外，飼糧中蛋白質(zhì)水平的變化對(duì)哺乳動(dòng)物食欲的影響具有不一致的研究結(jié)果。Kinzig等［11］研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白質(zhì)飼糧能夠通過(guò)刺激下丘腦中NPY的釋放引起小鼠的食欲。但 Morrison等［12］研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白質(zhì)飼糧更容易滿(mǎn)足機(jī)體需求，主要是通過(guò)抑制下丘腦中AgRP基因的表達(dá)來(lái)抑制小鼠食欲。不同蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)家兔食欲肽基因表達(dá)的影響目前尚未有研究。此外，目前商業(yè)上生長(zhǎng)肉兔顆粒料中蛋白質(zhì)水平在16%左右，而獺兔飼糧蛋白質(zhì)水平為17.5%時(shí)具有最高的飼料轉(zhuǎn)化效率［13］。因此，本試驗(yàn)擬研究飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)家兔食欲肽基因表達(dá)的影響，以探討飼糧蛋白質(zhì)水平從缺乏到滿(mǎn)足需要對(duì)家兔食欲肽基因表達(dá)的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇體重相近的30日齡斷奶伊拉肉兔30只，隨機(jī)分為3組，分別飼喂蛋白質(zhì)水平為12.8%、16.0%和19.2%的試驗(yàn)飼糧，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只兔。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，各組試驗(yàn)兔每天定量飼喂相應(yīng)飼糧。試驗(yàn)兔單籠飼養(yǎng)，采用常規(guī)飼養(yǎng)管理和免疫程序，自然采光、通風(fēng)，自由飲水，3～5d消毒兔舍1次。預(yù)試期7d，正試期35d。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)期間每天統(tǒng)計(jì)采食量，每周稱(chēng)1次體重，飼料轉(zhuǎn)化效率由試驗(yàn)期間的采食量與體增重計(jì)算得出。試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取8只試驗(yàn)兔，心臟采血（肝素抗凝），3 000r／min離心10min，分離血漿，－20℃冷凍保存待測(cè)；然后將其頸椎錯(cuò)位致死，屠宰，采集十二指腸、空腸、回腸及ARC樣品，放入液氮速凍后，置于－80℃冰箱中保存。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets（air－dry basis） %

續(xù)表1

1.3 總RNA的提取與分析

下丘腦中總RNA用異硫氰二胍鹽法提取，利用瓊脂糖凝膠電泳和生物分光光度計(jì)分別檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度。按照TaKaRa RNA PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為：500ng RNA、5mmol／L MgCl2、1μL RT buffer、1mmol／L dNTP、2.5UAMV、0.7nmol／L oligo d（T）和10URibonuclease inhibitor，加焦碳酸二乙酯（DEPC）水至10μL。42℃反應(yīng)40min，99℃滅活反應(yīng)5min，5℃反應(yīng)5min。

cDNA合成以后進(jìn)行熒光定量PCR。熒光定量PCR引物（表2）是根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求設(shè)計(jì)，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，通過(guò)對(duì)混合樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定確定引物的質(zhì)量及最佳的稀釋濃度。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μL：10μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、0.4μL PCR Forward Primer（10μmol／L）、0.4μL PCR Reverse Primer（10μmol／L）、0.4 μL ROX Reference DyeⅡ（50×）、2μL cDNA模板和6.8μL dH2O。PCR循環(huán)參數(shù)為：95.0℃預(yù)變性10s；95.0℃變性5s；60℃延伸和退火34s，共40個(gè)循環(huán)。

參照 Livak等［14］的方法用2－ΔΔCt法定量目標(biāo)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，以甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）作為參照基因進(jìn)行校正。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA法進(jìn)行單因素方差分析，如果處理效應(yīng)差異顯著，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05為差異顯著。

表2 相關(guān)基因的引物序列Table 2 Primer sequences of related genes

2 結(jié) 果

如圖1所示，隨著飼糧中蛋白質(zhì)水平的增加，家兔的平均日增重逐漸增加（圖1－A），而料重比逐漸降低（圖1－B），其中19.2%蛋白質(zhì)飼糧組的平均日增重顯著高于12.8%和16.0%蛋白質(zhì)飼糧組（P＜0.05），而料重比3組間均有顯著差異（P＜0.05）。

圖1 飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)家兔生產(chǎn)性能的影響Fig.1 Effects of dietary protein level on performance of rabbits

通過(guò)比較16.0%蛋白質(zhì)飼糧組ARC和不同腸道組織中CCK基因的相對(duì)表達(dá)量（圖2），可看出十二指腸CCK基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于空腸、回腸和ARC（P＜0.05）。

圖2 家兔CCK基因在不同組織中的表達(dá)Fig.2 CCKgene expression in different tissues of rabbits

從圖3中可看出，與16.0%蛋白質(zhì)飼糧組相比，12.8%蛋白質(zhì)飼糧組十二指腸、回腸和ARC中CCK及ARC中POMC、CART、NPY 和AgRP基因的相對(duì)表達(dá)量都沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）。與16.0%和12.8%蛋白質(zhì)飼糧組相比，19.2%蛋白質(zhì)飼糧組十二指腸中CCK基因的相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P＜0.05，圖3－A），而其回腸、ARC中CCK基因的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化（P＞0.05，圖3－B和圖3－C）；19.2%蛋白質(zhì)飼糧組顯著增加ARC中POMC和CART基因的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05，圖3－F和圖3－G），而其 ARC中 NPY 和AgRP基因的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化（P＞0.05，圖3－D和圖3－E）。

3 討 論

CCK作為胃腸激素和腦腸肽，廣泛分布于消化系統(tǒng)、中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)等組織和器官中。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，家兔的CCK基因主要表達(dá)部位是十二指腸，其次是回腸，ARC和空腸中幾乎沒(méi)有CCK基因的表達(dá)。在家兔上得到的結(jié)果與在小鼠上得到的結(jié)果稍有差異，小鼠CCK基因表達(dá)的主要部位也為十二指腸，其次是空腸和下丘腦，最后是回腸［15］。這些結(jié)果說(shuō)明CCK的表達(dá)具有種屬和組織特異性。CCK作為飽感信號(hào)起到抑制食欲的作用，是外周攝食調(diào)節(jié)的主要生理因子［6］。外周［16］和腦室［17］注射CCK都顯著降低了肉仔雞的采食量。哺乳動(dòng)物CCK的釋放受到飼糧中蛋白質(zhì)和脂肪水平的影響，Wang等［10］指出，引起CCK釋放的因素按刺激的強(qiáng)弱排列為蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物、脂酸鈉、鹽酸、脂肪。在本試驗(yàn)中，蛋白質(zhì)水平為19.2%的組顯著增加了十二指腸中CCK基因的相對(duì)表達(dá)量。這一結(jié)果說(shuō)明飼糧蛋白質(zhì)水平為19.2%的組家兔的低采食量與十二指腸中CCK基因的高表達(dá)有關(guān)。此外，在哺乳動(dòng)物中，CCK還能夠抑制腸道的排空［18］。CCK還可以通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制胃的排空，如向下丘腦內(nèi)注入CCK28可降低胃內(nèi)壓，減慢胃排空。因此，本試驗(yàn)結(jié)果也暗示出飼糧蛋白質(zhì)水平為19.2%的組家兔的低食欲可能是由CCK抑制了腸道排空速率所導(dǎo)致的。

圖3 飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)家兔食欲肽基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of dietary protein level on appetitive peptide gene expression of rabbits

NPY在動(dòng)物的攝食活動(dòng)中發(fā)揮著十分重要的食欲促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，饑餓、禁食、泌乳等能量需求增加的行為，可增強(qiáng)下丘腦中NPY信號(hào)，并隨進(jìn)食活動(dòng)的持續(xù)逐漸降低，這表明NPY參與攝食的啟動(dòng)與維持［19］。此外，中樞注射N(xiāo)PY可使嚙齒類(lèi)動(dòng)物產(chǎn)生特征性的夜間陣發(fā)性進(jìn)食行為［20］。研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高蛋白質(zhì)飼糧顯著增加了小鼠下丘腦中NPY基因的表達(dá)［11］。在本試驗(yàn)中，飼糧蛋白質(zhì)水平并沒(méi)有顯著影響到家兔ARC中NPY基因的表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明飼糧對(duì)ARC中NPY基因表達(dá)的影響具有種屬特異性，家兔ARC中NPY神經(jīng)元并不是飼糧蛋白質(zhì)水平影響家兔食欲的靶點(diǎn)。

AgRP是中樞黑皮質(zhì)素系統(tǒng)的拮抗劑，它與黑皮質(zhì)素系統(tǒng)的激動(dòng)劑α促黑素細(xì)胞激素（α－MSH）競(jìng)爭(zhēng)性與黑皮質(zhì)素受體4（MC4R）結(jié)合，抑制其厭食的作用［21］。中樞注射AgRP可以引起攝食增加作用，這種攝食增加的作用比中樞注射N(xiāo)PY所引起的攝食增加作用持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)［22］。對(duì)于NPY基因敲除的小鼠，AgRP增加食欲的信號(hào)仍然有效，這可能的解釋是AgRP與NPY作用通路是并行的［23］。小鼠ARC中AgRP基因的表達(dá)不僅受到飼糧中能量水平的影響［24］，還受到蛋白質(zhì)水平的影響，與飼喂20%蛋白質(zhì)飼糧的小鼠相比，飼喂10%蛋白質(zhì)飼糧的小鼠下丘腦中AgRP基因的表達(dá)顯著增加［12］。本試驗(yàn)中，飼糧蛋白質(zhì)水平的改變并沒(méi)有顯著影響到家兔ARC中AgRP基因的表達(dá)。這一結(jié)果暗示，家兔ARC中AgRP神經(jīng)元可能沒(méi)有參與蛋白質(zhì)水平調(diào)控家兔食欲的過(guò)程。

POMC在下丘腦內(nèi)合成和加工后成α－MSH，其可通過(guò)腦內(nèi)G蛋白偶聯(lián)受體黑皮質(zhì)素受體3（MC3R）與MC4R作用發(fā)揮其分解代謝的生物效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)POMC基因的表達(dá)激發(fā)時(shí)，其產(chǎn)物α－MSH通過(guò)其受體激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，從而減少攝食；當(dāng)能量匱乏時(shí)，AgRP基因的表達(dá)增加，與α－MSH競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 MC4R，降低其厭食作用［25］。馮軍等［13］研究發(fā)現(xiàn)，飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)飼料轉(zhuǎn)化效率的影響主要與采食量有關(guān)，飼糧蛋白質(zhì)水平與采食量呈負(fù)相關(guān)，這可能與下丘腦中POMC含量的變化有關(guān)，飼糧蛋白質(zhì)水平為19.2%的組家兔的ARC中POMC基因的相對(duì)表達(dá)量顯著增加。相同的結(jié)果也出現(xiàn)在大鼠的試驗(yàn)中［11］。這些結(jié)果說(shuō)明ARC中POMC神經(jīng)元能夠感受到飼糧中蛋白質(zhì)水平的變化。此外，在大鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，外周CCK可以促進(jìn)下丘腦中POMC基因的表達(dá)，從而降低采食量［9］。在本試驗(yàn)中，飼糧蛋白質(zhì)水平為19.2%的組家兔十二指腸中CCK和ARC中POMC基因的表達(dá)具有相同的趨勢(shì)，這一結(jié)果暗示CCK／POMC信號(hào)通路可能參與蛋白質(zhì)水平影響家兔食欲過(guò)程，此推論還需進(jìn)一步去驗(yàn)證。

CART具有抑制攝食、激活交感神經(jīng)系統(tǒng)、防止體重增加的作用。禁食時(shí)，CART基因在ARC中表達(dá)受到抑制，而高脂飲食促進(jìn)了CART基因的表達(dá)［26］。飼糧中蛋白質(zhì)水平的變化對(duì)ARC中CART基因表達(dá)的影響還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，在本試驗(yàn)中，19.2%蛋白質(zhì)飼糧顯著增加了ARC中CART基因的表達(dá)，這說(shuō)明飼糧中蛋白質(zhì)可能通過(guò)影響ARC中CART基因的表達(dá)調(diào)節(jié)家兔食欲。此外，與其他能量調(diào)節(jié)神經(jīng)肽一樣，CART的作用也是相互協(xié)調(diào)的。在ARC中，CART神經(jīng)元上表達(dá)POMC，說(shuō)明CART與黑皮質(zhì)素系統(tǒng)關(guān)系密切［27］。飼喂19.2%蛋白質(zhì)飼糧家兔 ARC 中CART與POMC基因的表達(dá)共同升高可能與此有關(guān)。此外，飼喂19.2%蛋白質(zhì)飼糧家兔ARC中CART基因表達(dá)的變化還可能與外周CCK有關(guān)，Pete等［28］研究發(fā)現(xiàn)外周注射CCK后能夠激活下丘腦中CART基因的表達(dá)。

4 結(jié) 論

飼喂低蛋白質(zhì)水平（12.8%～16.0%）飼糧家兔食欲增加與腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中腦腸肽有關(guān)。與低蛋白質(zhì)水平飼糧比較，高蛋白質(zhì)水平（19.2%）飼糧顯著提高了十二指腸中CCK 和ARC中CART和POMC基因的相對(duì)表達(dá)量，表明這些基因形成食欲網(wǎng)絡(luò)共同參與飼糧蛋白質(zhì)調(diào)控家兔食欲的過(guò)程。此外，回腸和ARC中CCK、下丘腦中NPY和AgRP基因?qū)︼暭Z中蛋白質(zhì)水平變化不敏感。

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