賈安峰 馮京海* 張敏紅 李澤陽，2 常 玉 徐勝勝 何 川

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥 230036;3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036)

集約化養(yǎng)殖條件下畜禽容易發(fā)生免疫應(yīng)激，嚴(yán)重影響畜禽的健康和生長性能。雖然脂多糖(LPS)不是實(shí)際生產(chǎn)中導(dǎo)致動物免疫應(yīng)激的唯一或主要因素，但LPS可模擬動物免疫應(yīng)激，且重復(fù)性好［1］，因而被廣泛用于免疫應(yīng)激機(jī)理［1-4］及營養(yǎng)干預(yù)研究［5-8］。目前常采用注射大腸桿菌LPS誘導(dǎo)畜禽免疫應(yīng)激，研究免疫應(yīng)激時(shí)的營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)［5-8］。單次注射LPS可引起動物血漿中炎癥細(xì)胞因子濃度急劇升高，但4～8 h即恢復(fù)至注射前水平［9］，因此僅能模擬急性短期免疫應(yīng)激。一些研究人員采用多次重復(fù)注射LPS的方式模擬慢性免疫應(yīng)激，但畜禽對LPS極易產(chǎn)生耐受性［10-11］。為降低LPS的耐受性，延長免疫激活的時(shí)間，Rakhshandeh等［1］采用隔天重復(fù)注射 LPS，每次注射劑量遞增12%的方法，發(fā)現(xiàn)LPS提高注射期內(nèi)生長豬的體溫、血漿白細(xì)胞數(shù)量和急性期蛋白含量，表明重復(fù)注射遞增劑量的LPS可以誘導(dǎo)慢性免疫應(yīng)激，是一種研究生長豬慢性免疫激活時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)代謝和營養(yǎng)干預(yù)的適宜模型［1］。隨后研究人員采用該模型研究了慢性免疫應(yīng)激與熱應(yīng)激的互作［4］、慢性免疫應(yīng)激過程中唾液應(yīng)激指標(biāo)的變化［3］以及營養(yǎng)調(diào)控［8］。Paulo 等［4］在研究中發(fā)現(xiàn)，第1次注射LPS后血漿炎性細(xì)胞因子水平顯著升高，但隨后注射LPS不再引起炎性細(xì)胞因子水平的升高，表明即使注射劑量遞增12%，仍不足以緩解生長豬對LPS的耐受性。另外，研究發(fā)現(xiàn)免疫應(yīng)激降低仔豬平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)［5-6，12-13］和增 重 耗 料 比 (G/F)［4，6-7，14］，但對飼料消化率的研究較少。本試驗(yàn)旨在研究遞增30%注射LPS誘導(dǎo)仔豬慢性免疫應(yīng)激的效果及對仔豬飼糧營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用 18 頭(28±2)日齡斷奶仔豬［(8.22±0.89)kg］，單籠適應(yīng) 5 d 后，參考 Carroll等［15］的方法，實(shí)施非手術(shù)法頸靜脈插管(MMCVCB 1-20-13，北京天地和協(xié)公司)。插管護(hù)理5 d，剔除拉稀瘦弱仔豬2頭。采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將剩余16頭隨機(jī)分為2個組(對照組、LPS組)，每組8個重復(fù)。試驗(yàn)期15 d，LPS組分別在試驗(yàn)第1、3、5、7、9、11、13 和 15 天給仔豬靜脈注射 LPS(L2880，Sigma)，初始按80μg/kg BW 注射，以后注射劑量每次遞增30%，對照組注射相應(yīng)劑量的生理鹽水。整個試驗(yàn)期仔豬自由飲水，每天08:00、12:00、16:00和20:00飼喂仔豬基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 樣品采集與測定方法

1.2.1 生長性能

分別在試驗(yàn)第1、5、9和15天靜脈注射前稱取仔豬體重和飼糧重，并據(jù)此計(jì)算ADG、ADFI和G/F。

1.2.2 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率測定

以個體為單位，記錄試驗(yàn)第5～10天采食量，并收集試驗(yàn)第5～10天全部糞便，當(dāng)天糞樣混合均勻后稱重，取1/2于65℃烘干，室溫回潮后稱重，-20℃保存。參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》［16］測定飼糧樣品和糞樣中干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)和總能(GE)。飼糧中各營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率計(jì)算公式如下:

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=［(飼糧某養(yǎng)分總量-糞中某養(yǎng)分總量)/飼糧某養(yǎng)分總量］×100。

1.2.3 血漿指標(biāo)測定

分別在試驗(yàn)前1 天(-1 d)和試驗(yàn)第1、5、9、13天LPS注射3 h后從頸靜脈插管中抽取10 mL血液，置于肝素鈉抗凝管中，靜置 30 min，3 000 r/min離心15 min，分離血漿，-20℃保存，用于測定皮質(zhì)醇、結(jié)合珠蛋白、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)含量。

結(jié)合珠蛋白和IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;皮質(zhì)醇ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的差異采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件中一般混合線性模型(GLM)進(jìn)行單因素重復(fù)測量方差分析和Duncan氏法多重比較;同一時(shí)間點(diǎn)不同組間的差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 遞增注射LPS對仔豬血漿中IL-1β、結(jié)合珠蛋白和皮質(zhì)醇含量的影響

由表2可知，t檢驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)前(-1 d)LPS組仔豬血漿中各指標(biāo)與對照組之間無顯著差異(P＞0.10);試驗(yàn)第 1、5 天 LPS 組血漿中 IL-1β、結(jié)合珠蛋白和皮質(zhì)醇含量均極顯著高于對照組(P＜0.01);試驗(yàn)第9天LPS組血漿中結(jié)合珠蛋白含量極顯著高于對照組(P=0.01)，皮質(zhì)醇含量有高于對照組的趨勢(P=0.10);試驗(yàn)第13天LPS組血漿中除結(jié)合珠蛋白含量顯著高于對照組(P＜0.05)外，IL-1β和皮質(zhì)醇含量均與對照組無顯著差異(P＞0.10)。上述結(jié)果表明，隔天注射LPS至第9天時(shí)，LPS仍具有明顯的免疫激活作用，但隨著注射次數(shù)的增加，仔豬對LPS的耐受性逐漸增強(qiáng)，即使增大注射劑量，LPS免疫激活作用仍逐漸降低。

經(jīng)重復(fù)測量方差分析得出，注射前后對照組仔豬血漿中IL-1β、結(jié)合珠蛋白和皮質(zhì)醇含量無顯著差異(P＞0.10)，而LPS組各項(xiàng)指標(biāo)均有極顯著變化(P＜0.01)，其中與注射前(-1 d)相比，試驗(yàn)第1、5天仔豬血漿中IL-1β、結(jié)合珠蛋白和皮質(zhì)醇含量均顯著升高(P＜0.05)，試驗(yàn)第 9、13天除結(jié)合珠蛋白含量仍較高(P＜0.05)外，血漿IL-1β和皮質(zhì)醇含量恢復(fù)至注射前水平。重復(fù)測量方差分析的結(jié)果與t檢驗(yàn)的結(jié)果基本一致。

表2 遞增注射LPS對仔豬血漿中IL-1β、結(jié)合珠蛋白和皮質(zhì)醇含量的影響Table 2 Effects of increasing administration of lipopolysaccharide on the contents of IL-1β，haptoglobin and cortisol in plasma of piglets

2.2 遞增注射LPS對仔豬生長性能的影響

由表3可見，與對照組相比，注射LPS導(dǎo)致仔豬3個階段ADG分別降低了40.00%(P＜0.01)、29.52%(P＜0.05)和 19.30%(P＜0.05);ADFI分別降低了 25.09%(P=0.01)、23.15%(P＜0.05)和19.47%(P＜0.05);G/F 無顯著差異(P＞0.10)。上述結(jié)果表明，在整個試驗(yàn)期內(nèi)注射LPS對仔豬ADG和ADFI均有顯著影響，但隨著注射次數(shù)的增加，LPS對仔豬的影響逐漸減小，表明仔豬對LPS的耐受性逐漸增強(qiáng)。

經(jīng)重復(fù)測量方差分析得出，隨日齡增加，對照組仔豬 ADFI和 ADG極顯著增加(P＜0.01)，而G/F無顯著變化(P＞0.10);隨著日齡和LPS注射次數(shù)的增加，LPS組仔豬的ADG和ADFI同樣極顯著增加(P＜0.01);另外LPS組仔豬后期(9～15 d)G/F顯著高于前期(1 ～8 d，P＜0.05)，表明隨注射次數(shù)的增加，仔豬對LPS的耐受性逐漸增強(qiáng)。

表3 遞增注射LPS對仔豬生長性能的影響Table 3 Effects of increasing administration of lipopolysaccharide on growth performance of piglets(n=8)

2.3 遞增注射LPS對仔豬營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表4可見，注射LPS導(dǎo)致仔豬DM表觀消化率下降了5.43%(P＜0.05)，有降低 GE表觀消化率的趨勢(P=0.06)，EE和CP的表觀消化率雖略有降低，但未達(dá)到顯著水平(P＞0.10)。

表4 遞增注射LPS對仔豬營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響Table 4 Effects of increasing administration of lipopolysaccharide on nutrient apparent digestibility of piglets(n=8)%

3 討論

3.1 遞增注射LPS對仔豬血漿中IL－1β、結(jié)合珠蛋白和皮質(zhì)醇含量的影響

雖然LPS不是畜禽生產(chǎn)中誘發(fā)免疫應(yīng)激的唯一因素，但作為一種非病原性免疫激活劑，注射后可引起畜禽血漿炎性細(xì)胞因子水平升高，影響下丘腦-垂體-腎上腺、甲狀腺和生長軸［4，8］，誘導(dǎo)畜禽出現(xiàn)精神抑郁、食欲不振、嗜睡、發(fā)熱等典型的免疫應(yīng)激現(xiàn)象［4］，并且LPS誘導(dǎo)畜禽免疫應(yīng)激的重復(fù)性好，具有較好的生物安全性［1］，因而被廣泛用于免疫應(yīng)激［1-4］及營養(yǎng)干預(yù)的相關(guān)研究［5-8］。但是LPS免疫應(yīng)激模型存在一定的局限性，首先LPS只能誘導(dǎo)短期急性免疫應(yīng)激，單次注射LPS可引起動物血漿中炎癥細(xì)胞因子濃度急劇升高，但4～8 h即恢復(fù)至注射前水平［9］，而多次重復(fù)注射容易使畜禽產(chǎn)生 LPS耐受性［10-11］。Rakhshandeh等［1］采用隔天重復(fù)注射LPS，每次注射劑量遞增12%的方法降低LPS的耐受性，成功誘導(dǎo)生長豬慢性免疫應(yīng)激。然而Paulo等［4］應(yīng)用該模型發(fā)現(xiàn)，第1次注射LPS后豬血漿炎性細(xì)胞因子水平顯著升高，但隨后注射LPS不再引起炎性細(xì)胞因子水平的升高，表明即使注射劑量遞增12%，仍不足以緩解生長豬對LPS的耐受性。本試驗(yàn)LPS初始注射劑量為80μg/kg BW，隨后逐次遞增30%，發(fā)現(xiàn)隨著注射次數(shù)的增加，LPS免疫激活的作用仍逐漸降低，但是至試驗(yàn)第5天血漿IL-1β依然維持顯著高含量，而且在整個試驗(yàn)期內(nèi)結(jié)合珠蛋白始終維持高含量，表明本試驗(yàn)采用的遞增注射LPS的方法可誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生慢性免疫應(yīng)激，且效果優(yōu)于 Rakhshandeh 等［1］的模型。

3.2 遞增注射LPS對仔豬生長性能的影響

畜禽發(fā)生免疫應(yīng)激時(shí)采食量和生長速度顯著下降［4-6，14］，本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，仔豬應(yīng)激期間 ADFI和ADG顯著降低。免疫應(yīng)激可能通過以下機(jī)制抑制畜禽的采食和生長速度:1)促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子過量分泌［7，9］，炎性細(xì)胞因子作用于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，抑制畜禽的采食行為及代謝［17］，直接注射IL-1可顯著降低肉雞的ADG和ADFI證明了這一機(jī)制［18］;2)抑制生長激素和 IGF的分泌，進(jìn)而降低畜禽的 ADG 和 ADFI［7，12，19］;3)抑制甲狀腺素的分泌［4］，降低食糜在胃腸道中流通速度，抑制采食;4)促進(jìn)糖皮質(zhì)激素分泌［6，20］，通過 mTOR通道調(diào)控肉雞采食行為［21］，本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)血漿中皮質(zhì)醇含量顯著升高。

免疫應(yīng)激除抑制畜禽采食和生長外，還降低畜禽的飼料轉(zhuǎn)化效率［4-5，7，14］。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然LPS組的G/F與對照組無顯著差異(這可能由于樣本量少，組內(nèi)變異過大，掩蓋了組間差異)，但重復(fù)測量方差分析發(fā)現(xiàn)，LPS組仔豬后期G/F顯著高于前期，間接表明注射LPS降低了飼料轉(zhuǎn)化效率。飼料轉(zhuǎn)化效率下降表明飼料消化率和飼料利用率降低。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，遞增注射LPS降低了飼料DM的表觀消化率，有降低GE表觀消化率的趨勢。有關(guān)免疫應(yīng)激影響仔豬飼料消化率的研究很少，但是有研究發(fā)現(xiàn)，免疫應(yīng)激時(shí)仔豬腸道中脂肪酶、胰蛋白酶活性顯著降低［22］，小腸指數(shù)和大腸指數(shù)顯著降低［23］，腸道的絨毛高度顯著降低，隱窩深度顯著增加［24］，導(dǎo)致小腸線粒體損傷［25］，提高小腸HSP70的表達(dá)［2］。這些結(jié)果表明，免疫應(yīng)激對畜禽的影響是全身性的，可能通過降低采食量影響飼料的消化率和利用率，抑制畜禽的生長。

4 結(jié)論

①遞增30%注射LPS提高仔豬5 d內(nèi)血漿IL-1β和皮質(zhì)醇含量，并使整個注射期內(nèi)血漿結(jié)合珠蛋白含量顯著升高，ADG和ADFI顯著降低。表明遞增30%注射LPS誘導(dǎo)仔豬出現(xiàn)慢性免疫應(yīng)激，抑制了仔豬生長。

②遞增30%注射LPS可降低仔豬飼料DM表觀消化率，有降低GE表觀消化率的趨勢。

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