孫盛明 朱 健* 戈賢平 江曉浚

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，無錫 214081;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，無錫 214081)

生物絮團技術(shù)(biofloc technology，BFT)被認為是解決集約化養(yǎng)殖水質(zhì)污染的有效技術(shù)，利用這種養(yǎng)殖技術(shù)，可以實現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖少換水甚至不換水，同時還維持了養(yǎng)殖水體生態(tài)的穩(wěn)定［1］。碳氮比一直是生物絮團技術(shù)的主要研究熱點之一，控制合適的碳氮比是形成絮團的必要條件。Avnimelech［2］建立假設(shè)模型計算得出當(dāng)養(yǎng)殖水體中碳氮比為15.75時，可以促進微生物合成菌體蛋白，并有效去除養(yǎng)殖水體氨氮和亞硝酸鹽氮。團頭魴(Megalobrama amblycephala)是我國的四大家魚之一，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占有極為重要的地位。本實驗室前期研究已經(jīng)證實，生物絮團技術(shù)應(yīng)用于團頭魴的養(yǎng)殖體現(xiàn)出飼料系數(shù)降低、水質(zhì)環(huán)境改善和生長加快等綜合效應(yīng)［3］，而生物絮團對團頭魴腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用未見專門報道。

長期以來，研究者們主要通過純培養(yǎng)的方法對腸道菌群的構(gòu)成進行研究。然而，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前研究人員越來越多的使用變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)等方法對腸道中的微生物進行全面的分析［3－6］。近年來，以454焦磷酸測序為代表的新一代測序技術(shù)憑借低成本、高通量、流程自動化的優(yōu)勢為研究微生物群落結(jié)構(gòu)提供了新的技術(shù)平臺［7］，目前已應(yīng)用到人類、昆蟲和魚類等腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究中［8－10］。本研究通過使用454焦磷酸測序技術(shù)同時結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)研究零換水條件下養(yǎng)殖水體中碳氮比對生物絮團形成和團頭魴腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，為生物絮團技術(shù)在淡水魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

根據(jù)Avnimelech［2］總結(jié)的生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)的碳氮比公式計算得出碳源葡萄糖的添加量，根據(jù)飼料投喂量調(diào)整葡萄糖的添加量以保持各組的碳氮比，試驗中的碳氮比指添加物質(zhì)(飼料和葡萄糖)的碳元素與氮元素的質(zhì)量比。水體中碳、氮含量的計算公式如下:

式中:ΔC為碳含量;ΔCH為所需要的碳水化合物的添加量;%C為碳水化合物中碳的百分含量;ΔN為氮含量;feed為每天投喂給團頭魴的飼料量;%N feed為飼料中的氮的百分含量;%N excretion為團頭魴的排泄物中氮的百分含量。

根據(jù)上述計算方法推算，本試驗設(shè)置了5個碳氮比組，其碳氮比分別為8(CN8組，設(shè)為對照組)、12(CN12組)、16(CN16組)、20(CN20組)、24(CN24組)，碳源葡萄糖的添加方式為每次投喂飼料后1 h，把投喂的碳源與少量養(yǎng)殖水體混合攪拌，全池均勻潑灑。

1.2 試驗魚與飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心大浦試驗基地進行，試驗所用團頭魴由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉試驗基地提供，馴化14 d后，將300尾體質(zhì)健康、規(guī)格一致的團頭魴幼魚隨機分入15個室內(nèi)水泥池(1.0 m×4.0 m×0.6 m)，平均水深 0.4 m，放養(yǎng)密度為20尾/池。將15個水泥池隨機分為5組，每組設(shè)置3個平行，每個水泥池中設(shè)置微孔增氧管，置于水泥池的底部，微孔增氧管通過無規(guī)共聚聚丙烯管(PPR管)與池邊一個5 kW的鼓風(fēng)機相連接，保持連續(xù)充氣。養(yǎng)殖期間每天定時投喂3次團頭魴商品飼料(粗蛋白質(zhì)含量為30%)，每天定量投食，日投飼量為團頭魴體質(zhì)量的3%左右，每周根據(jù)攝食和生長情況作適當(dāng)調(diào)整。試驗期間不換水，只補充因滲漏、蒸發(fā)及采樣而丟失的水量。試驗期間24 h不間斷供氧，期間水溫為18～24℃，pH 為 7.7～8.5，溶解氧濃度＞5 mg/L。養(yǎng)殖水源為經(jīng)過沉淀、過濾后的池塘水。試驗過程中盡量減少人為干擾，防止對魚產(chǎn)生額外應(yīng)激，每日觀察魚攝食及死亡情況，發(fā)現(xiàn)死魚及時撈出稱重記數(shù)，并檢查死亡原因。

養(yǎng)殖周期8周，每隔1周采集水樣1次。采樣時，在09:00用1 L柱狀采水器在水泥池四角和中央采集水樣5 L，混合待用。取混合水樣550 mL，冷藏帶回實驗室用于檢測相關(guān)水質(zhì)指標(biāo)。檢測指標(biāo)包括:氨氮(NH3-N)、亞硝酸鹽氮()及生物絮團含量。生物絮團含量測定用1 L柱狀采水器，分別于每組3個平行中取水樣3 L混合，再取混合水樣1 L倒入英霍夫錐形管中，靜止沉淀30 min后，根據(jù)英霍夫錐形管所標(biāo)刻度讀數(shù)。

1.3 樣品采集

在不同碳氮比組分別隨機挑選3尾魚，無菌采集腸道內(nèi)容物，裝入經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的 Eppendrorf管中，經(jīng)液氮預(yù)凍后，－80℃保存。

1.4 DNA提取和454焦磷酸測序及數(shù)據(jù)分析

分別提取不同碳氮比組中的腸道內(nèi)容物樣品DNA。DNA提取和PCR擴增參照Zhang等［11］的方法。PCR產(chǎn)物割膠回收，測定DNA濃度。每組的3個生物學(xué)重復(fù)的PCR產(chǎn)物，分別取100 ng等量混合。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司通過高通量測序平臺454 GS FLT Titanium對樣品16S rRNA基因的V3區(qū)進行測序。參照文獻［12－15］，將獲得的序列通過Mothur軟件，刪掉長度小于200 bp的序列，根據(jù)DNA barcode將序列確定到每個樣品，并去除barcode和引物序列件。去雜后的數(shù)據(jù)與Sliva數(shù)據(jù)庫比對，利用Mothur軟件分別進行二次去雜和去除嵌合體。將相似度大于97%的DNA序列歸為1個操作分類單元(OUT)，利用Mothur軟件對序列進行OUT聚類，用于樣品間的相似性分析，并繪制樣品的稀疏曲線，評估不同樣品的多樣性。將序列提交至RDP數(shù)據(jù)庫得到每條序列的分類單元(RDP分類對屬的域值為0.5)，物種分類單元為6層(界、門、綱、目、科、屬)，并分析零換水養(yǎng)殖條件下不同碳氮比對團頭魴魚種腸道菌群相對豐度的影響。

1.5 變性梯度凝膠電泳測定方法

1.5.1 16S rDNA-V3 可變區(qū)的 PCR 擴增

本試驗采取將DNA提取物稀釋100倍的純化方法。按文獻［16］提供的擴增方法，采用帶GC夾(GC-clamp)細菌通用引物341F(5'－CCTACGGGAGGCAGCAG－3')和 534R(5'－ATTACCGCGGCTGCTGG－3')進行細菌基因組DNA的擴增，GC-clamp序列為 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG GGGGG，擴增片段為細菌的16S rDNA的V3可變區(qū)。PCR擴增采用50μL體系，其中包括:10×LAPCR Buffer(Mg2+Plus)5 μL，10 mmol/L dNTP 4μL，10μmol/L 上、下游引物各 1μL，5 U/μL LATaq DNA 聚合酶 0.5 μL，50 ng/μL 模板 DNA 2.0 μL，滅菌去離子水 37.5 μL。整個過程采用降落PCR模式(touchdown-PCR)，程序如下:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 s，之后每個循環(huán)退火溫度降低0.5℃，循環(huán)20次，在這個退火溫度下再進行15個循環(huán)，72℃最終延伸5 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。從瓊脂糖凝膠中回收純化PCR產(chǎn)物，采用大連寶生物工程公司的膠回收純化試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit)進行，過程參照試劑盒中的使用說明進行操作。

1.5.2 PCR 擴增產(chǎn)物的 DGGE

將PCR擴增產(chǎn)物通過DGGE進行分離，采用的凝膠變性梯度為35%～55%，濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠(化學(xué)變性劑為100%尿素7 mol/L和40%的丙烯酰胺)，在 1×TAE緩沖液中 150 V 60℃下電泳5 h，電泳完畢后采用銀染的方法進行染色，銀染結(jié)束后利用凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

部分試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統(tǒng)計分析，若差異顯著時，再進行Tukey’s多重比較，顯著水平為 P＜0.05，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 零換水條件下養(yǎng)殖水體中碳氮比對水質(zhì)的影響

由圖1可知，零換水條件下養(yǎng)殖水體中不同碳氮比形成的生物絮團含量不同，CN20和CN24組生物絮團含量高于其他組;各組氨氮和亞硝酸鹽氮含量在前期都出現(xiàn)了一個高峰，并均在第35天降到一個較低點，之后比較穩(wěn)定;不同養(yǎng)殖時間時CN20和CN24組氨氮和亞硝酸鹽氮含量均低于對照組。結(jié)果顯示，碳氮比≥16時，生物絮團在一定程度上降低了水體中的氨氮和亞硝酸鹽氮含量，進而改善了水質(zhì)。

圖1 各組養(yǎng)殖水體中生物絮團、氨氮、亞硝酸鹽氮含量變化Fig.1 Changes of bioflocs，NH3-N andcontents in cultured water in different groups

2.2 零換水條件下養(yǎng)殖水體中碳氮比對團頭魴腸道菌群多樣性的影響

圖2 為不同碳氮比組團頭魴腸道菌群的稀疏曲線，橫坐標(biāo)代表隨機抽取的測序數(shù)據(jù)量，縱坐標(biāo)代表觀測到的OUT數(shù)。相同序列數(shù)時低碳氮比(CN8和 CN12組)比高碳氮比(CN16、CN20、CN24組)的OUT數(shù)多，表明零換水養(yǎng)殖條件下高碳氮比時團頭魴腸道菌群多樣性低于低碳氮比時，說明養(yǎng)殖水體中碳氮比能夠影響團頭魴的腸道菌群的多樣性。

2.3 零換水條件下養(yǎng)殖水體中碳氮比對團頭魴腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

由表1可知，團頭魴魚種腸道中厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢菌，二者占菌群總量的80%以上。各組團頭魴腸道中放線菌門(Actinobateria)含量變化不顯著(P＞0.05)。與對照組相比，CN16和CN20組團頭魴腸道厚壁菌門含量顯著增加(P＜0.05)，而梭桿菌門(Fusobacteria)和變形菌門含量顯著減少(P＜0.05)。對各組團頭魴腸道中厚壁菌門進行深入分析發(fā)現(xiàn)，在綱水平上其組成也各不相同(表2)。與對照組相比，CN16、CN20和CN24組團頭魴腸道中梭菌綱(Clostridia)含量顯著減少(P＞0.05)，而芽孢桿菌綱(Baccilli)含量顯著增加(P＞0.05)。

圖2 各組團頭魴的腸道菌群稀疏曲線分析Fig.2 Rarefaction curve analysis of intestinal microflora of blunt anout bream(Megalobrama amblycephala)in different groups

表1 各組團頭魴的腸道菌群結(jié)構(gòu)Table 1 Intestinal microflora structure of blunt anout bream(Megalobrama amblycephala)in different group %

表2 各組團頭魴腸道菌群中厚壁菌門在綱水平上的組成Table 2 Firmicutes composition by class in intestinal microflora of blunt anout bream(Megalobrama amblycephala)in different groups %

2.4 團頭魴腸道細菌16Sr DNA DGGE指紋圖譜建立、聚類分析及相似系數(shù)分析

由圖3可知，比較團頭魴腸道微生物16S rDNA V3可變區(qū)片段的DGGE指紋圖譜中各條帶的相對光密度發(fā)現(xiàn)，部分條帶光密度變化明顯受到不同養(yǎng)殖水體碳氮比的影響。有的條帶在各組中均出現(xiàn)，如條帶18;有的條帶只在對照組中出現(xiàn)，如條帶 1和 2，有的條帶只在試驗組(CN12、CN16、CN20和 CN24組)中出現(xiàn)，如條帶 14、15和16。

圖3 不同碳氮比養(yǎng)殖條件下團頭魴腸道細菌16S r DNA DGGE指紋圖譜Fig.3 Intestinal microflora 16S rDNA PCR-DGGE fingerprint of blunt anout bream(Megalobrama amblycephala)cultured in different C/N ratios

由圖4可知，不同碳氮比養(yǎng)殖條件明顯改變團頭魴幼魚腸道的微生態(tài)環(huán)境，團頭魴腸道樣品在聚類圖上各自聚為一簇，其中碳氮比較高的2個組(CN20和CN24組)相似性最高，聚為一類后再與CN16組聚為一類;碳氮比的較低的對照組與其他組相似性最低，說明零換水養(yǎng)殖條件下適宜碳氮比能夠保持團頭魴腸道細菌群落組成相對穩(wěn)定性。

圖4 不同碳氮比養(yǎng)殖條件下團頭魴腸道菌群的聚類分析Fig.4 Cluster anlysis of intestinal microflora of blunt anout bream(Megalobrama amblycephala)cultured in different C/N ratios

3 討論

以色列學(xué)者Avbimelech系統(tǒng)地提出了養(yǎng)殖系統(tǒng)中投入的碳氮比對養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)調(diào)控的生物絮團反應(yīng)機制理論，并將生物絮團技術(shù)應(yīng)用到實際生產(chǎn)中，有效降低了養(yǎng)殖水體中的氨氮以及亞硝酸氮含量［2］。自2001年起，美國南卡羅來納州已將生物絮團技術(shù)應(yīng)用到海水對蝦的養(yǎng)殖系統(tǒng)中，不僅可以調(diào)節(jié)水質(zhì)，提高對蝦成活率，而且可以轉(zhuǎn)化殘餌糞便，降低飼料系數(shù)，在高密度對蝦養(yǎng)殖過程中效果尤為顯著［17－18］。近幾年，生物絮團技術(shù)也應(yīng)用到羅非魚(Oreochromis niloticus)［19］、草魚(Ctenopharyngodon idellus)［20］和 鳙 (Aristichthys nobilis Richardson)［21］等淡水魚類養(yǎng)殖中，本實驗室近期研究表明，草食性魚類團頭魴能夠攝食生物絮團作為魚類潛在的天然餌料，以降低魚類的飼料系數(shù)并促進其生長［22］。生物絮團的形成需要依靠異養(yǎng)微生物，會消耗養(yǎng)殖水體的氨氮和亞硝酸鹽氮作為其生長繁殖所需氮源，與此同時也需消耗大量有機碳源，合理的碳氮比是形成生物絮團的必要條件［23］。本試驗結(jié)果表明，團頭魴養(yǎng)殖水體中適宜碳氮比能夠有效增加水體中生物絮團含量，有效降低氨氮和亞硝酸鹽氮含量，故此，生物絮團技術(shù)應(yīng)用于團頭魴養(yǎng)殖適宜的碳氮比為≥16，該比值能促進生物絮團的形成，并能有效降低水中的氨氮、亞硝酸鹽氮含量，這與盧炳國等［20］對草魚的研究結(jié)果相一致。

夏耘等［24］報道，生物絮團優(yōu)勢菌與草魚腸道內(nèi)容物細菌構(gòu)成上有相似之處。本研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖水體中不同碳氮比形成的生物絮團對團頭魴腸道內(nèi)容物中梭桿菌門和放線菌門含量無顯著影響，而顯著影響了厚壁菌門和變形菌門含量。當(dāng)養(yǎng)殖水體中碳氮比為16～20時，厚壁菌門含量顯著高于其他試驗組，而變形菌門顯著低于其他試驗組。芽孢桿菌綱是厚壁菌門的一綱，包含有芽孢桿菌目和乳桿菌目2目，其下包含有芽孢桿菌屬等革蘭氏陽性菌，在維持動物腸道健康中起重要作用。變形菌門是革蘭氏陰性細菌，是細菌中最大的一門，包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌、螺桿菌等種類［25］。已有研究報道，芽孢桿菌(Bacillus)為絮團培養(yǎng)至10 d時的特異菌，也是一類重要的產(chǎn)絮菌［26－27］。沈斌乾等［28］研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌能改善養(yǎng)殖用水水質(zhì)，作為飼料添加劑使用時能促進養(yǎng)殖動物生長，提高機體免疫及抗病能力。值得關(guān)注的是，本研究采用焦磷酸測序法發(fā)現(xiàn)了團頭魴腸道中存在藍菌門，藍菌又稱藍藻、藍細菌、藍綠菌或藍綠藻，原被認為是一門藻類植物，后有人把藍菌劃為原核生物的一門，稱為藍菌門(Cyanobacteria)［25］，這或許與團頭魴的草食食性相關(guān)。由此可見，整個腸道菌群的數(shù)量和適當(dāng)?shù)谋壤龑τ诰S持腸道內(nèi)環(huán)境微生態(tài)平衡以及魚類的腸道健康等有重要意義，而團頭魴腸道菌群結(jié)構(gòu)隨養(yǎng)殖水體環(huán)境的變化而改變，這與Wu等［15］對草魚的研究結(jié)果相吻合。

變性凝膠電泳圖譜分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖水體中適宜的碳氮比形成的生物絮團能夠改變團頭魴的腸道菌群結(jié)構(gòu)。江曉浚等［22］發(fā)現(xiàn)，團頭魴能夠攝食生物絮團，并且添加不同碳源形成的生物絮團顯著影響團頭魴生長、消化酶活性和抗氧化能力，故此推測，團頭魴通過攝食不同含量生物絮團改變了其腸道菌群結(jié)構(gòu)。不同碳氮比形成的生物絮團存在著特定的生態(tài)位群落結(jié)構(gòu)，陶金莉等［29］提供了一個比較合理的解釋，芽孢桿菌屬通過寡肽介導(dǎo)的群體效應(yīng)實現(xiàn)自身能力維持及孢子的形成，氣單胞菌屬通過群體效應(yīng)產(chǎn)生胞外蛋白酶，并能促進生物膜的形成，對生物絮團結(jié)構(gòu)的維持可能起到一定作用。由此可見，零換水養(yǎng)殖水體中不同含量的生物絮團對維持團頭魴腸道內(nèi)環(huán)境微生態(tài)平衡具有重要作用。

4 結(jié) 論

①養(yǎng)殖水體中碳氮比增加，團頭魴腸道菌群多樣性降低，團頭魴腸道中厚壁菌門含量顯著增加，梭桿菌門和變形菌門含量顯著降低。

②以團頭魴腸道菌群結(jié)構(gòu)為評價指標(biāo)，零換水條件下團頭魴養(yǎng)殖水體中適宜碳氮比為16～20。

［1］ DE SCHRYVER P，VERSTRAETE W.Nitrogen removal from aquaculture pond water by heterotrophic nitrogen assimilation in lab-scale sequencing batch reactors［J］.Bioresource Technology，2009，100(3):1162－1167.

［2］ AVNIMELECH Y.Carbon/nitrogen ratio as a control element in aquaculture systems［J］.Aquaculture，1999，176(3/4):227－235.

［3］ EGLI K，LANGER C，SIEGRIST H R，et al.Community analysis of ammonia and nitrite oxidizers during start-up of nitritation reactors［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69(6):3213－3222.

［4］ FIGUEROLA E L M，ERIJMAN L.Bacterial taxa abundance pattern in an industrial wastewater treatment system determined by the full rRNA cycle approach［J］.Environmental Microbiology，2007，9(7):1780－1789.

［5］ STAMPER D M，WALCH M，JACOBS R N.Bacterial population changes in a membrane bioreactor for graywater treatment monitored by denaturing gradient gel electrophoretic analysis of 16S rRNA gene fragments［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69(2):852－860.

［6］ WANG X H，WEN X H，YAN H J，et al.Bacterial community dynamics in a functionally stable pilotscale wastewater treatment plant［J］.Bioresource Technology，2011，102(3):2352－2357.

［7］ ROESCH L F W，F(xiàn)ULTHORPE R R，RIVA A，et al.Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity［J］.The ISME Journal，2007，1(4):283－290.

［8］ TURNBAUGH P J，HAMADY M，YATSUNENKO T，et al.A core gut microbiome in obese and lean twins［J］.Nature，2009，457(7228):480－484.

［9］ 周小潔，佟穎，錢坤，等.454測序技術(shù)在醫(yī)學(xué)昆蟲研究中的應(yīng)用［J］.寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報，2012，19(2):116－121.

［10］ 張小平，王一冰，鄧斌，等.添加不同益生菌對草魚養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)的影響［J］.水生生物學(xué)報，2014，38(3):459－466.

［11］ ZHANG X P，F(xiàn)U L Q，DENG B，et al.Bacillus subtilis SC02 supplementation causes alterations of the microbial diversity in grass carp water［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2013，29(9):1645－1653.

［12］ SCHLOSS P D，WESTCOTT S L，RYABIN T，et al.Introducing mothur:open-source，platform-independent，community-supported software for describing and comparing microbial communities［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75(23):7537－7541.

［13］ PRUESSE E，QUAST C，KNITTEL K，et al.SILVA:a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB［J］.Nucleic Acids Research，2007，35(21):7188－7196.

［14］ WANG Q，GARRITY G M，TIEDJE J M，et al.Na?ve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73(16):5261－5267.

［15］ WU SG，WANG G T，ANGERT E R，et al.Composition，diversity，and origin of the bacterial community in grass carp intestine［J］.PLoS One，2012，7(2):e30440.

［16］ 李曉，李冰，董玉峰，等.精養(yǎng)團頭魴池塘沉積物微生物群落的結(jié)構(gòu)特征及組成多樣性分析［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2013，28(2):218－227.

［17］ BURFORD M A，THOMPSON P J，MCINTOSH R P，et al.The contribution of flocculated material to shrimp(Litopenaeus vannamei)nutrition in a high-intensity，zero-exchange system［J］.Aquaculture，2004，232(1/2/3/4):525－537.

［18］ KUHN D D，LAWRENCE A L，BOARDMAN G D，et al.Evaluation of two types of bioflocs derived from biological treatment of fish effluent as feed ingredients for Pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei［J］.Aquaculture，2010，303(1/2/3/4):28－33.

［19］ CRAB R，KOCHVA M，VERSTRAETE W，et al.Bioflocs technology application in over-wintering of tilapia［J］.Aquacultural Engineering，2009，40(3):105－112.

［20］ 盧炳國，王海英，謝駿，等.不同C/N水平對草魚池生物絮團的形成及其水質(zhì)的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2013，37(8):1220－1228.

［21］ 李朝兵.生物絮團作為鳙餌料的研究與應(yīng)用［D］.博士學(xué)位論文.上海:上海海洋大學(xué)，2012:27－37.

［22］ 江曉浚，孫盛明，戈賢平，等.添加不同碳源對零換水養(yǎng)殖系統(tǒng)中團頭魴魚種生長、腸道生化指標(biāo)和水質(zhì)的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2014，38(8):1113－1122.

［23］ HARI B，KURUP B M，VARGHESE J T，et al.The effect of carbohydrate addition on water quality and the nitrogen budget in extensive shrimp culture systems［J］.Aquaculture，2006，252(2/3/4):248－263.

［24］ 夏耘，郁二蒙，謝駿，等.基于PCR-DGGE技術(shù)分析生物絮團的細菌群落結(jié)構(gòu)［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2012，36(10):1563－1571.

［25］ BUCHANAN R E.伯杰細菌鑒定手冊［M］.8 版.中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組，譯.北京:科學(xué)出版社，1984:729－735.

［26］ SHIH I L，YAN Y T，YEH L C，et al.Production of a biopolymer flocculant from Bacillus licheniformis and its flocculation properties［J］.Bioresource Techenology，2001，78(3):267－272.

［27］ VIJAYALAKSHMI S P，RAICHUR A M.The utility of Bacillus subtilis as a bioflocculant for fine coal［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2003，29(4):265－275.

［28］ 沈斌乾，陳建明，郭建林，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對青魚生長、消化酶活性和魚體組成的影響［J］.水生生物學(xué)報，2013，37(1):48－53.

［29］ 陶金莉，遲莉麗，沈亞領(lǐng)，等.細菌的群體行為調(diào)控機制－Quorum sensing［J］.微生物學(xué)通報，2004，31(4):106－110.