趙娜，馬維紅△，蘇贏，翟振麗，覃曉瑩

牛蒡根水提物對高血壓大鼠血管內(nèi)皮損傷的保護作用

趙娜1，馬維紅1△，蘇贏2，翟振麗3，覃曉瑩4

目的探討牛蒡根水提物對高血壓大鼠血管內(nèi)皮損傷的保護作用及機制。方法用N-硝基-L-精氨酸（L-NNA)復(fù)制高血壓大鼠模型,隨機分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組（卡托普利15 mg/kg）、牛蒡根水提物低劑量組（0.5 g/kg）、牛蒡根水提物中劑量組（1.0 g/kg）及牛蒡根水提物高劑量組（2.0 g/kg），連續(xù)灌胃6周，測定大鼠用藥后1、4、7、10、13、16、19、22、29、36、42 d的收縮壓；6周后，檢測大鼠血清C-反應(yīng)蛋白（CRP）、白介素-6（IL-6）水平，取大鼠胸主動脈，測細胞間黏附分子-1（ICAM-1）水平。結(jié)果（1）牛蒡根水提物組的大鼠尾動脈收縮壓低于模型對照組（P＜0.05）。（2）牛蒡根水提物可顯著改善血管的內(nèi)皮損傷程度，抑制內(nèi)膜內(nèi)皮細胞脫落及血細胞黏附，并抑制中膜平滑肌細胞、膠原纖維增殖等。（3）牛蒡根水提物組的血清IL-6、CRP炎癥因子及血管內(nèi)皮ICAM-1表達水平低于模型對照組(P＜0.05）。結(jié)論牛蒡根水提物對高血壓大鼠血管內(nèi)皮損傷具有明顯改善作用，其機制可能與其抑制炎癥因子IL-6、CRP及ICAM-1的表達，改善高血壓大鼠血管內(nèi)皮慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)。

牛蒡；高血壓；內(nèi)皮,血管；C反應(yīng)蛋白質(zhì)；白細胞介素6；胞間黏附分子1

高血壓病是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。⒛X卒中等心腦血管疾病的發(fā)病原因之一，其發(fā)病機制復(fù)雜。近些年研究表明血管內(nèi)皮細胞損傷既為高血壓的病理結(jié)果，又是其致病因素，是“內(nèi)皮—高血壓—心血管事件”鏈的重要組分[1]，因此，改善血管內(nèi)皮功能為治療高血壓病的重要靶點。牛蒡是菊科牛蒡?qū)?年生草本植物，也稱東洋參，牛蒡根為牛蒡的肉質(zhì)直根，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降低血糖及血尿酸、擴管等作用[2-6]。但國內(nèi)外少見有關(guān)牛蒡根水提取物在高血壓血管內(nèi)皮損傷機制中的研究報道。本研究旨在觀察牛蒡根水提物對高血壓大鼠模型的血壓、血管內(nèi)皮形態(tài)變化及炎癥因子表達水平的影響，探討其對高血壓大鼠血管內(nèi)皮損傷的保護作用及機制，從而為牛蒡根水提物的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑SPF級雌性Wistar大鼠60只，12周齡，270～300 g，購自桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證編號：SCXK（桂）2013-0001。牛蒡根水提物（西安昌岳生物科技有限公司，批號：20140106，規(guī)格10∶1）；N-硝基-L-精氨酸（LNNA，北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：N009711）；卡托普利（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：MB1527）。大鼠C-反應(yīng)蛋白（CRP）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司；大鼠細胞白介素-6（IL-6）ELISA檢測試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器ALC-HTP動物恒溫系統(tǒng)及ALC-NIBP無創(chuàng)血壓測量分析系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；光柵型連續(xù)波長酶標(biāo)儀（美國伯樂）；微量臺式高速冷凍離心機（Thermo公司）；光學(xué)顯微照相系統(tǒng)及OLYMPUS BX60型光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組將大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為6組，每組10只：正常對照組、模型對照組、陽性對照組、牛蒡根水提物低劑量組、牛蒡根水提物中劑量組及牛蒡根水提物高劑量組，實驗前先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.3.2 高血壓大鼠模型的建立除正常對照組外，余5組參考文獻[7-8]，將L-NNA按照15 mg/(kg·d)劑量分2次腹腔注射以制備高血壓大鼠模型，在大鼠清醒、安靜、恒溫（37℃左右）狀態(tài)下，于每日17:00用ALC-NIBP無創(chuàng)血壓測量分析系統(tǒng)監(jiān)測尾動脈血壓，連續(xù)測3次，每次間隔60 s，取平均值作為結(jié)果。

1.3.3 給藥方法每天上午9:00用大號灌胃針按1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃給藥，牛蒡根水提物低、中、高劑量組分別給予0.5、1.0、2.0 g/(kg·d)牛蒡根水提物，陽性對照組給予卡托普利15 mg/(kg·d)，余2組給予同量生理鹽水。連續(xù)給藥6周，每周稱體質(zhì)量1次，并調(diào)整給藥量。

1.3.4 收縮壓測定在恒溫環(huán)境中，于大鼠安靜、清醒狀態(tài)下監(jiān)測用藥后1、4、7、10、13、16、19、22、29、36、42 d的收縮壓。

1.3.5 CRP、IL-6檢測禁食12 h后，給予10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，于腹主動脈取血4 mL，靜置、分離血清，ELISA法測CRP、IL-6，實驗嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.6 胸主動脈組織形態(tài)學(xué)觀察取胸主動脈血管置入4%中性多聚甲醛中固定、脫水透明及石蠟包埋切片，HE染色后于×200高倍鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化并攝片。

1.3.7 ICAM-1檢測將胸主動脈切片脫蠟至水后，用檸檬酸抗原修復(fù)液（pH=6）進行高壓熱修復(fù)，3%過氧化氫室溫孵育10 min，再依次按1∶80滴加一抗，孵育60 min，滴加二抗，孵育10～15 min,二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色3～10 min，最后水清洗、蘇木精復(fù)染、乙醇脫水、干燥、封片。以光鏡下觀察到內(nèi)皮細胞胞膜或胞漿內(nèi)棕褐（黃）色顆粒樣物質(zhì)為陽性表達，從每張切片中任意挑取5個不重疊視野，輸入到BI2000圖像分析系統(tǒng)中，測出陽性顆粒的平均光密度值（OD）來代表該標(biāo)本的蛋白質(zhì)表達水平。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡根水提物對高血壓大鼠收縮壓的影響在用藥前后不同時間收縮壓差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F時間=5 796.962，P＜0.001），各用藥組均是如此，用藥后收縮壓逐漸降低，到36 d時基本平穩(wěn)。各組之間收縮壓差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F組間=4 683.644，P＜0.001），給藥前，各用藥組、模型對照組的收縮壓高于正常對照組（P＜0.05），各用藥組與模型對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；用藥后1～42 d，各用藥組收縮壓均低于模型對照組（均P＜0.05），用藥36～42 d，牛蒡根水提物高劑量組、陽性對照組的收縮壓與正常對照組無明顯差異（P＞0.05)。組間和處理時間之間存在交互效應(yīng)（F交互=624.990，P＜0.001），見表1。

2.2 牛蒡根水提物對高血壓大鼠血清炎癥因子IL-6、CRP水平的影響模型對照組大鼠血清炎癥因子IL-6、CRP表達水平高于正常對照組(P＜0.05)，連續(xù)用藥6周后，牛蒡根水提物高、中、低劑量組大鼠IL-6、CRP表達水平均低于模型對照組(P＜0.05)，見表2。

2.3 牛蒡根水提物對高血壓大鼠胸主動脈形態(tài)的影響正常對照組:血管壁無增厚，各層膜結(jié)構(gòu)清晰、界限清楚，內(nèi)膜由單層排列整齊的內(nèi)皮細胞覆蓋，結(jié)構(gòu)完整，無內(nèi)皮細胞脫落及血細胞黏附；中膜可見多層排列規(guī)整的彈力纖維及平滑肌細胞；外膜為較薄的疏松結(jié)締組織，見圖1A。模型對照組:血管壁三層結(jié)構(gòu)存在，可見管壁增厚，內(nèi)膜不光滑且增厚,內(nèi)皮細胞部分損傷脫落，可見血細胞黏附；中膜彈性纖維及平滑肌細胞增生且排列紊亂，部分平滑肌細胞核與內(nèi)膜垂直并且有向內(nèi)膜遷移趨勢，可見空泡樣結(jié)構(gòu)；外膜細胞增生活躍，細胞核密度增加，見圖1B。陽性對照組與牛蒡根水提物高劑量組可明顯改善血管內(nèi)皮損傷，未見內(nèi)皮細胞脫落及血細胞黏附，彈力纖維排列有序；牛蒡根水提物中劑量組偶有內(nèi)皮細胞脫落及血細胞黏附，中膜可見空泡樣結(jié)構(gòu)；牛蒡根水提物低劑量組仍可見內(nèi)皮細胞脫落及血細胞黏附，內(nèi)膜增厚，彈力纖維排列較陽性對照組整齊，見圖1C～F。

2.4 牛蒡根水提物對高血壓大鼠血管內(nèi)皮ICAM-1蛋白表達水平的影響光鏡下觀察ICAM-1陽性表現(xiàn)為胸主動脈內(nèi)皮細胞胞膜及胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒，見圖2；與正常對照組相比，模型對照組ICAM-1表達水平顯著增高；陽性對照組及牛蒡根水提物高、中、低劑量組的ICAM-1表達水平低于模型對照組（P＜0.05），牛蒡根高劑量組、陽性對照組與正常對照組相比無明顯差異（P＞0.05），見表2。

Tab.1Changes of systolic blood pressure at different time points in six groups表1 各組不同時期收縮壓變化(n=10，mmHg，)

Tab.1Changes of systolic blood pressure at different time points in six groups表1 各組不同時期收縮壓變化(n=10，mmHg，)

1 mmHg=0.133 kPa；＊＊P＜0.01；a與正常對照組比，b與模型對照組比，P＜0.05

組別正常對照組模型對照組陽性對照組牛蒡根水提物高劑量組牛蒡根水提物中劑量組牛蒡根水提物低劑量組F給藥前108.42±2.23 204.13±1.83a 204.21±2.50a 204.64±1.69a 204.86±1.93a 204.47±2.31a 1 406.93＊＊給藥后1 d 112.39±1.18 204.58±2.02a 191.34±1.03ab 196.63±1.41ab 200.55±1.73ab 202.45±2.52ab 1 536.70＊＊給藥后4 d 110.47±2.28 203.91±2.39a 180.6±1.83ab 186.84±2.76ab 194.02±2.32ab 200.61±1.98b 959.79＊＊給藥后7 d 110.89±1.24 201.36±1.72a 168.59±1.36ab 176.42±2.81ab 187.02±2.40ab 194.55±2.21ab 900.52＊＊給藥后10 d 112.15±1.48 202.30±2.21a 157.83±6.36ab 167.32±1.68ab 179.26±2.53ab 186.36±2.42ab 396.27＊＊給藥后13 d 111.05±1.86 203.91±2.12a 145.23±3.08ab 157.26±2.78ab 170.18±3.12ab 180.22±3.58ab 543.94＊＊組別正常對照組模型對照組陽性對照組牛蒡根水提物高劑量組牛蒡根水提物中劑量組牛蒡根水提物低劑量組F給藥后16 d 110.20±1.46 202.51±2.76a 134.70±2.83ab 145.31±3.01ab 162.07±3.44ab 173.39±2.19ab 542.32＊＊給藥后19 d 109.79±1.21 201.33±2.56a 126.57±2.05ab 135.87±4.12ab 155.23±2.63ab 167.76±1.64ab 467.45＊＊給藥后22 d 110.08±1.77 202.33±2.44a 120.07±1.68ab 126.78±1.18ab 147.36±2.15ab 159.49±1.65ab 525.74＊＊給藥后29 d 112.13±1.80 201.49±2.05a 116.03±1.63ab 120.04±1.72ab 136.58±1.69ab 154.46±2.27ab 462.27＊＊給藥后36 d 111.47±1.34 202.18±2.27a 112.37±2.12b 115.11±1.89b 130.46±3.44ab 151.79±2.05ab 926.35＊＊給藥后42 d 110.83±1.57 201.42±2.01a 112.24±2.03b 115.41±1.08b 129.80±2.42ab 150.09±1.98ab 1 310.41＊＊F 4.41 2.92 1 429.89＊＊1 887.90＊＊1 124.62＊＊807.43＊＊

Tab.2Comparison of expression levels of serum inflammatory cytokines IL-6,CRP and ICAM-1 between six groups表2 各組血清炎癥因子IL-6、CRP水平及血管內(nèi)皮ICAM-1蛋白表達水平比較(n=10，)

Tab.2Comparison of expression levels of serum inflammatory cytokines IL-6,CRP and ICAM-1 between six groups表2 各組血清炎癥因子IL-6、CRP水平及血管內(nèi)皮ICAM-1蛋白表達水平比較(n=10，)

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比，b與模型對照組比，P＜0.05

組別正常對照組模型對照組陽性對照組牛蒡根水提物高劑量組牛蒡根水提物中劑量組牛蒡根水提物低劑量組F IL-6（ng/L) 9.16±0.53 39.71±1.11a 10.76±0.21b 11.21±0.34ab 25.24±1.01ab 28.98±1.20ab 983.62＊＊CRP（ng/L) 13.31±0.63 142.91±2.23a 14.50±0.96b 16.23±0.68b 54.34±1.81ab 71.95±1.41ab 6.89＊＊ICAM-1（OD）0.023±0.014 0.189±0.011a 0.038±0.007b 0.050±0.011b 0.102±0.020ab 0.159±0.014ab 131.62＊＊

3 討論

近些年相關(guān)研究證明，血管內(nèi)皮損傷與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。血管內(nèi)皮細胞內(nèi)分泌功能強大，其分泌的活性物質(zhì)如促炎因子單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血管細胞間黏附分子（VCAM-1）、CRP、IL-6、ICAM-1等，抗炎因子一氧化氮（NO）、前列腺素（PG）等。正常情況下，這些因子維持在平衡狀態(tài)，一旦血管內(nèi)皮受損，其內(nèi)分泌功能失調(diào)，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)增強，從而導(dǎo)致高血壓[9]。

CRP水平升高是心血管疾病的重要危險因素[10]，其可通過減少內(nèi)皮細胞對NO及PG的釋放,同時刺激內(nèi)皮素（ET）-1及ET-1免疫樣激活物釋放,并促進血管內(nèi)皮增生、內(nèi)膜增厚,增加血管重塑阻力，使血管收縮、血壓升高[11]。IL-6是由平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生的一種多功能細胞因子，其可通過降低血管內(nèi)皮前列環(huán)素水平，增加血管平滑肌細胞Ca2+通透性，使Ca2+含量增高，并使血管緊張素（Ang）Ⅱ受體上調(diào)，使血壓升高。IL-6還可刺激血小板源生長因子（PDGF)分泌，PDGF可促進成纖維細胞、血管平滑肌細胞增殖，誘導(dǎo)成纖維細胞、巨噬細胞向血管內(nèi)膜下游走、黏附及血管收縮,從而損傷血管內(nèi)皮[12]。ICAM-1是炎性反應(yīng)的可信標(biāo)志物[13]，正常情況下，ICAM-1很少表達或不表達，在炎癥因子、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）等刺激下表達增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷[14]，ICAM-1可通過介導(dǎo)血管平滑肌細胞增生、分化與遷移，從而導(dǎo)致大量膠原纖維、蛋白多糖等基質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致管壁增厚、變硬，血壓升高[15]。

本實驗結(jié)果顯示L-NNA所致的高血壓大鼠血清中炎性因子CRP、IL-6、血管內(nèi)皮ICAM-1表達均顯著高于正常對照組大鼠，提示高血壓大鼠血管內(nèi)皮損傷、中膜平滑肌顯著增厚，導(dǎo)致了動脈血管的重構(gòu)，證實了慢性炎癥狀態(tài)與主動脈內(nèi)皮損傷及血管重構(gòu)相關(guān)。實驗藥物牛蒡根水提物高(2.0 g/kg)、中(1.0 g/kg)、低(0.5 g/kg)劑量均可顯著降低高血壓大鼠收縮壓，改善胸主動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)，并抑制循環(huán)血液及血管內(nèi)皮內(nèi)炎癥因子的表達水平，證明了牛蒡根水提物可通過抑制炎癥反應(yīng)達到保護血管內(nèi)皮的作用。

綜上所述，牛蒡根水提物對高血壓大鼠模型具有良好降壓和保護血管內(nèi)皮的作用，其機制可能與減少炎癥因子CRP、IL-6及ICAM-1水平，抑制血管壁血細胞及內(nèi)皮細胞黏附、減輕管壁炎癥反應(yīng)有關(guān)。

（圖1、2見插頁）

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（2014-08-05收稿2014-09-30修回）

（本文編輯閆娟）

Protective effects of aqueous extract of arctium lappa root on vascular endothelial cell injury of hypertensive rats

ZHAO Na1,MA Weihong1△,SU Ying2,ZHAI Zhenli3,QIN Xiaoying4
1 The Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guangxi 541001,China;2 Yishui Central Hospital of Linyi;3 The First Hospital of Handan;4 Department of Clinical Medicine,Guilin Medical University△

ObjectiveTo study the protective effects and mechanism of aqueous extract of arctium lappa root on vascular endothelial cell injury in hypertensive rats.MethodsThe hypertensive rat model was induced by N-nitro-L-arginine.Rats were randomly divided into normal control group,model control group,positive control group(aptopril 15 mg/kg), low concentration of aqueous extract of arctium lappa root(0.5 g/kg),medium concentration of(1 g/kg)and high concentration of(2 g/kg)groups.After six weeks of continuous intragastric administration,the systolic blood pressure levels at tail artery were measured at 1,4,7,10,13,16,19,22,29,36 and 42 d after treatment.And other indicators related to inflammatory factors were detected including C-reactive protein(CRP)and interleukin(IL)-6.The intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)level was detected by taking samples of thoracic aorta.Results(1)The systolic blood pressure level at tail artery was significantly lower in aqueous extract of arctium lappa root group than that of model control group(P＜0.05).(2)The aqueous extract of arctium lappa root can significantly improve the vascular endothelial cell injury,suppress vascular endothelial cell loss and blood cell adhesion,and cell proliferation with collagen fibers in muscle membrane.(3)The serum levels of IL-6,CRP and vascular endothelial ICAM-1 were significantly reduced in aqueous extract of arctium lappa root group than that of model control group(P＜0.05).ConclusionAqueous extract of arctium lappa root can significantly improve vascular endothelial cell injury in hypertensive rats.The mechanism may be related to the inhibition of inflammatory cytokines like IL-6,CRP and the expression of ICAM-1,and the improvement of chronic inflammatory response in vascular endothelium of hypertensive rats.

arctium lappa；hypertension；endothelium,vascular；C-reactive protein；interleukin-6；intercellular adhesion molecule-1

R544.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.011

廣西中醫(yī)藥民族醫(yī)藥傳承創(chuàng)新專項課題(GZLC14-38);2014年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（G201410601005）；廣西壯族自治區(qū)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201410601019）

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（郵編541001）；2臨沂市沂水中心醫(yī)院；3邯鄲市第一醫(yī)院；4桂林醫(yī)學(xué)院

趙娜（1988），女，碩士在讀，主要從事心血管疾病研究

△通訊作者E-mail:gxgylqlq@163.com