閆旭，闞世廉，金曄

PTEN調(diào)節(jié)神經(jīng)樣細胞微管相關(guān)蛋白tau的聚集及意義

閆旭1,2，闞世廉2△，金曄3

目的觀察體外誘導成人骨髓基質(zhì)干細胞（BMSC）向神經(jīng)細胞分化過程中，在第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因（PTEN）調(diào)節(jié)細胞骨架中軸突標志分子微管相關(guān)蛋白tau（MAPT）分布及聚集的特征，并探討其意義。方法從成人骨髓中分離基質(zhì)干細胞，在體外經(jīng)細胞因子誘導分化2周后成為神經(jīng)樣細胞，將未分化的BMSC作為對照組；應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Western blot方法研究MAPT的表達變化；經(jīng)PTEN抑制劑BPV作用于該細胞后，用結(jié)合有熒光劑的鬼筆環(huán)肽直接染色細胞微絲肌動蛋白，并聯(lián)合用免疫熒光細胞化學方法染色MAPT，在激光共聚焦顯微鏡下觀察MAPT和肌動蛋白的定位及關(guān)聯(lián)性。結(jié)果成人骨髓來源的基質(zhì)干細胞經(jīng)誘導分化后，MAPT的mRNA在分化1周和2周時相對表達水平為0.24±0.04和0.52±0.04，高于對照組BMSC的0.04±0.02（P＜0.05）。MAPT蛋白表達水平分別為0.18±0.03和0.44±0.05，高于對照組0.06±0.04（P＜0.05）。細胞染色后，經(jīng)BPV作用后MAPT由彌散狀態(tài)變?yōu)榫奂癄顟B(tài)，并分布于細胞一側(cè)，神經(jīng)樣細胞開始出現(xiàn)極性。結(jié)論BMSC來源的神經(jīng)細胞分化成熟時，PTEN參與調(diào)節(jié)細胞骨架中軸突標志分子MAPT的轉(zhuǎn)運和聚集，為神經(jīng)細胞的軸突進一步生長提供物質(zhì)支持。

腫瘤抑制蛋白質(zhì)類；tau蛋白質(zhì)類；細胞骨架；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；免疫熒光測定；第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因

微管相關(guān)蛋白是細胞骨架中微管主干蛋白之外的一些蛋白成分，占微管總蛋白成分的5%～20%，其中微管相關(guān)蛋白tau（microtubule-associated protein tau，MAPT）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中非常豐富，而少見于其他細胞，并可作為神經(jīng)軸突的標志分子[1]。最近研究表明，抑癌基因PTEN下調(diào)可以促進視神經(jīng)軸突的再生[2]。但是PTEN如何影響神經(jīng)細胞骨架，尤其是神經(jīng)軸突內(nèi)的MAPT轉(zhuǎn)運和聚集的研究目前尚鮮見報道。本研究在體外成功誘導成人骨髓基質(zhì)干細胞（bone marrow stem cells，BMSC）向神經(jīng)細胞分化，旨在模擬神經(jīng)細胞的發(fā)育，并觀察PTEN調(diào)節(jié)的MAPT的分布變化，進一步分析PTEN下調(diào)在神經(jīng)軸突再生方面的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒購于美國HyClone公司。Hoechst 33258購于北京欣經(jīng)科公司。TRIzol購于美國Invitrogen公司。Ficoll-Paque Plus購于瑞典Amersham Biosciences。BSA購于美國Roche公司，表皮細胞生長因子（EGF）購于英國Pepro Tech公司。Oligo（dT）、MMLV和Taq DNA聚合酶購于美國Promega公司。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）和Phalloidin-FITC購于美國Sigma公司。PTEN抑制劑BPV購于美國Calbiochem公司。細胞裂解液及Western blot相關(guān)試劑盒購于美國Thermo公司。TRITC和辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG購于北京中杉金橋。兔抗多物種MAPT多克隆抗體和兔抗多物種β-actin多克隆抗體購于日本Abcam。

1.2 方法

1.2.1 成人骨髓基質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞取自成人開胸手術(shù)中棄置的肋骨。4℃無菌狀態(tài)下用生理鹽水沖出骨髓，在Ficoll-Paque分離液中2 000 r/min，20 min離心分離出單個核細胞，以細胞計數(shù)器計數(shù)。將原代細胞以1×105/cm2密度接種于明膠包被的100 mL培養(yǎng)瓶中，未貼壁細胞換液時被去除。不進行分化的BMSC培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中。在10%FBS的DMEM/F12中再加入10 μg/L NGF、10 μg/L BDNF和10 μg/L EGF誘導細胞分化。原代細胞在培養(yǎng)1周和2周后以Trypsin-乙二胺四乙酸（EDTA）消化，計數(shù)后以1×105/cm2密度接種于35 mm培養(yǎng)皿中傳代培養(yǎng)，以備研究。所有培養(yǎng)細胞置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，隔日給予半量更換培養(yǎng)基。

1.2.2 神經(jīng)細胞骨架中軸突標志分子MAPT mRNA的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及半定量分析BMSC和其誘導分化第1周和2周的細胞分別用TRIzol法提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為1 μg RNA及Oigo（dT）10 μL，5×Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 1.5 μL，40 U/μL RNA酶抑制劑（rRNasin）1 μL，50 U/μL M-MLV 4 μL，加去DEPC水至25 μL，37℃反應(yīng)60 min。MAPT基因的引物于上海生工生物工程有限公司合成，見表1。PCR體系包括10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，25 μmol/L引物正義鏈0.5 μL，25 μmol/L反義鏈0.5 μL，10 U/μLTaq DNA合成酶0.125 μL，cDNA 2.5 μL，加去DEPC水至25 μL。PCR程序為95℃3 min，94℃30 s，根據(jù)引物要求在58℃下退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)后，72℃下作用10 min，實驗重復3次。取PCR產(chǎn)物5 μL在3%瓊脂糖凝膠中90 V電泳30 min，應(yīng)用TANON Gis-2016型紫外讀膠儀（上海）觀察，目標基因表達水平取其特異條帶與相應(yīng)β-actin條帶灰度比值，經(jīng)Gis 3.74凝膠圖像處理系統(tǒng)分析后獲得。

Tab.1Primer sequences of MAPT and β-actin gene表1 MAPT和β-actin基因特異性引物序列表

1.2.3 Western blot檢測6孔板中BMSC、誘導分化1周和2周的神經(jīng)樣細胞共3組各取4孔，加人蛋白裂解液充分裂解后，12 000×g、4℃離心8 min，收集上清，提取總蛋白用于后續(xù)實驗。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各樣品總蛋白含量。按每孔20 μg上樣10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，50 g/L BSA封閉，以β-actin為內(nèi)參。加入1∶1 000稀釋的一抗（兔抗多物種MAPT和β-actin多克隆抗體）4℃過夜孵育，次日TBST（Tris-HCl、NaCl和Tween-20混合物）緩沖液洗膜后再加入二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG（工作濃度為1∶1 000），室溫孵育1 h，增強化學發(fā)光（ECL）法檢測顯影，重復實驗3次。TANON Gis-2016型紫外讀膠儀（上海）觀察，經(jīng)Gis 3.74凝膠圖像處理系統(tǒng)進行灰度值定量，目標蛋白表達水平取其特異條帶與相應(yīng)β-actin條帶灰度比值。按照Thermo公司試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 用PTEN抑制劑BPV處理神經(jīng)樣細胞BMSC定向誘導分化2周的神經(jīng)樣細胞以Trypsin-EDTA消化，計數(shù)后以1×105/cm2密度接種于底部預置直徑13 mm玻片的6孔培養(yǎng)板中傳代后培養(yǎng)，玻片表面包被Matrigel基質(zhì)膠作為細胞外基質(zhì)，有利于細胞發(fā)生極化。PTEN抑制劑BPV以終濃度200 nmol/L溶于含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，處理傳代培養(yǎng)的細胞，作用維持1周。未經(jīng)BPV處理的細胞傳代后用含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，作為陰性對照。所有培養(yǎng)細胞置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，隔日給予半量更換培養(yǎng)液。

1.2.5 細胞骨架肌動蛋白染色結(jié)合有綠色熒光劑FITC的鬼筆環(huán)肽（Phalloidin-FITC）和細胞骨架中的肌動蛋白特異性結(jié)合，使細胞骨架顯示綠色。經(jīng)過和未經(jīng)過PTEN抑制劑BPV培養(yǎng)的細胞用PBS洗凈，4%多聚甲醛在室溫下固定5 min，用PBS充分洗凈。細胞用0.1%的Triton X-100冰上透化處理30 min或更長。用50 mg/L Phalloidin-FITC 100 μL在室溫下作用40 min，用PBS充分洗凈。

1.2.6 MAPT免疫熒光細胞化學染色肌動蛋白經(jīng)染色后，該細胞加入100 μL1∶50稀釋的一抗（兔抗多物種MAPT多克隆抗體），4℃過夜孵育，抗體稀釋液為3%BSA的PBS溶液。每個檢測應(yīng)包括2組對照，分別為：（1）與一抗同一種屬、類型的無關(guān)抗體組，以檢測染色的特異性。（2）未加一抗的對照組，以檢測二抗染色的背景。洗掉未結(jié)合的一抗，二抗為1∶200稀釋后的TRITC標記的山羊抗兔IgG，用含0.2%Triton X-100的PBS洗3次，Hoechst 33258復染細胞核。吸干后用80%甘油/PBS封片，在Leica TSF ST2激光共聚焦顯微鏡下觀察10個以上視野、采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包分析，各組各時間點目標基因表達灰度值以均數(shù)±標準差表示；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法；并以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MAPT mRNA表達成人BMSC體外定向誘導分化1周和2周2時點神經(jīng)細胞軸突特異性標志分子MAPT mRNA水平均高于對照組BMSC，灰度值顯示在BMSC中MAPT的mRNA幾乎沒有表達，見圖1、表2。

Fig.1MAPT mRNA expressions in different time points by RT-PCR圖1 RT-PCR法檢測各時間點MAPT mRNA的表達

2.2 MAPT蛋白表達神經(jīng)樣細胞MAPT蛋白表達水平1周和2周均高于對照組BMSC中的表達水平，灰度值顯示在BMSC中幾乎沒有MAPT蛋白的表達，見圖2、表2。

Fig.2MAPT expressions in different time points by Western blot analysis圖2 Western blot法檢測分化各時間點MAPT蛋白的表達

2.3 MAPT在神經(jīng)樣細胞中的分布特征神經(jīng)樣細胞中的MAPT染色為紅色，在未經(jīng)BPV處理前彌散在整個細胞漿中，與經(jīng)Phalloidin-FITC染色為綠色的細胞骨架中的微絲肌動蛋白沒有關(guān)聯(lián)，見圖3 a；經(jīng)PTEN抑制劑BPV作用后，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)紅色的MAPT開始聚集，細胞開始出現(xiàn)極化，并和綠色的肌動蛋白存在共定位現(xiàn)象，染色呈黃色，見圖3 b。

Tab.2Comparison of MAPT between three groups表2 各組細胞MAPT監(jiān)測指標結(jié)果比較（n=3）

Tab.2Comparison of MAPT between three groups表2 各組細胞MAPT監(jiān)測指標結(jié)果比較（n=3）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，P＜0.05

組別BMSC（1）分化1周（2）分化2周（3）F mRNA 0.04±0.02 0.24±0.04a0.52±0.04ab157.622＊＊蛋白0.06±0.04 0.18±0.03a0.44±0.05ab106.588＊＊

3 討論

3.1 神經(jīng)細胞內(nèi)細胞骨架的特征細胞骨架不僅在維持細胞形態(tài)、承受外力、保持細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性方面起重要作用，而且還參與許多重要的生命活動，如在細胞分裂中細胞骨架牽引染色體分離；在細胞物質(zhì)運輸中，各類小泡和細胞器可沿著細胞骨架定向轉(zhuǎn)運；同樣在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)軸突再生過程中發(fā)揮著重要的作用[3]。神經(jīng)細胞軸突和樹突的伸展均與細胞骨架有關(guān)。細胞骨架主要由微管、微絲和中間纖維（IF）等蛋白質(zhì)構(gòu)架而成。所有微管均由約55 ku的α及β微管蛋白組成。微管是細胞骨架的架構(gòu)主干，同時也是某些細胞器的主體，可作為膜泡運輸?shù)膶к?。從各種組織中提純微管蛋白可以發(fā)現(xiàn)還存在一些其他蛋白成分，稱之為微管相關(guān)蛋白（microtube-associated proteins，MAPs），即微管由微管蛋白及微管相關(guān)蛋白組成[4]。國內(nèi)有研究表明，在多種原因引起的腦或脊髓神經(jīng)細胞損傷后，神經(jīng)再生時MAPs的表達和裝配發(fā)生變化[5-6]。

3.2 MAPT在神經(jīng)系統(tǒng)中的特征由于MAPs的作用和酶修飾有關(guān)，使得微管形成的某些結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，并參與多種細胞功能。這些蛋白具有組織特異性，如神經(jīng)細胞軸突中MAPT蛋白就可作為神經(jīng)軸突的標志物。MAPT蛋白編集微管系統(tǒng)構(gòu)成神經(jīng)細胞骨架成分。MAPT蛋白為含磷酸基蛋白，是含量最高的MAPs。正常成熟腦中MAPT蛋白分子含2～3個磷酸基。MAPT蛋白與微管蛋白結(jié)合，促進形成微管，并維持微管穩(wěn)定性，降低微管蛋白分子的解離，并誘導微管成束。隨著分化成熟，細胞骨架中MAPT可作為軸突的標志物，只有在神經(jīng)細胞軸突內(nèi)可見，并隨神經(jīng)軸突向遠端延伸，其密度逐漸增加[7]。BMSC在體外經(jīng)多種細胞因子和（或）化學試劑的定向誘導下，可分化成具有功能的神經(jīng)細胞，該方法已經(jīng)在前期的研究中證實[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)細胞分化過程中，在mRNA水平，軸突標志性分子MAPT開始表達，為軸突生長提供轉(zhuǎn)錄的模板；經(jīng)Western blot證實在蛋白質(zhì)水平，MAPT蛋白開始表達，為軸突生長提供物質(zhì)準備，并為軸突的進一步生長提供物質(zhì)保障。

阿爾茨海默病患者腦的MAPT蛋白異常過度磷酸化，MAPT蛋白總量多于正常人，且正常MAPT蛋白減少而異常過度磷酸化，MAPT蛋白大量增加，也失去其促進微管裝配形成的生物學功能、喪失維持微管穩(wěn)定的作用，并從微管上奪取這些蛋白，導致微管解聚，破壞正常的微管系統(tǒng)，造成神經(jīng)沖動傳導障礙[9]。有研究表明PTEN的高表達可使MAPT過度磷酸化，進而破壞微管系統(tǒng)[10]。

3.3 PTEN調(diào)節(jié)MAPT蛋白的聚集特征及意義在周圍神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中，如何調(diào)控神經(jīng)軸突的生長和再生的分子機制尚不清楚。在對神經(jīng)發(fā)育時軸突生長和神經(jīng)損傷時軸突再生這兩個有共性的生物學過程的分子機制研究中，揭示了PTEN基因獨立且重要的分子機制。這一細胞信號轉(zhuǎn)導通路可影響神經(jīng)細胞體內(nèi)多種生理現(xiàn)象，例如調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)運；也可以影響軸突的生長，例如細胞骨架的構(gòu)建和裝配。PTEN含張力蛋白（tensin）的同源序列，tensin作用于肌動蛋白，使整合素介導的細胞黏附分子磷酸化，降低肌動蛋白水平和細胞骨架隨機的方向性聚合，抑制細胞的遷移與游走。免疫熒光染色后，通過激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，PTEN受抑制后，軸突標志性蛋白由散在狀態(tài)轉(zhuǎn)為聚集狀態(tài)，并與細胞骨架的微絲結(jié)構(gòu)肌動蛋白產(chǎn)生關(guān)聯(lián)或以某種方式結(jié)合，開始軸突的生長。從而證實了PTEN在神經(jīng)軸突發(fā)生過程中及細胞骨架的構(gòu)建中起重要的調(diào)節(jié)作用。

總之，PTEN的下調(diào)可影響神經(jīng)細胞骨架中軸突標志分子MAPT由彌散狀態(tài)轉(zhuǎn)為聚集狀態(tài)，使神經(jīng)樣細胞形成極化，為進一步發(fā)展成有功能的神經(jīng)細胞作準備。在今后的實驗中將探討PTEN如何調(diào)控細胞骨架中軸突標志蛋白MAPT逐漸向軸突遠端轉(zhuǎn)運的機制，并進一步探討周圍神經(jīng)損傷后PTEN調(diào)節(jié)軸突的再生機制。

（圖3見插頁）

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（2014-06-09收稿2014-08-26修回）

（本文編輯李鵬）

Aggregation of microtubule-associated protein tau modulated by PTEN during the differentiation of bone marrow stem cell-derived nerve cells

YAN Xu1，2,KAN Shilian2△,JIN Ye3
Graduate School,Tianjin Medical University，Tianjin 300070,China；2 Tianjin Hospital；3 Central Laboratory,Peking Union Medical College Hospital△

ObjectiveTo observe the diffusion and aggregation of the microtubule associated protein tau（MAPT）modulated by phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN）during the nerve cell differentiation by human bone marrow stem cells（BMSC）in vitro,and to analyse the signification.MethodsAdult bone marrow stem cells were isolated and induced into nerve-like cells by some cytokines in vitro.The mRNA expression of MAPT was detected by semiquantitative RT-PCR and Western blot assay.The patterns of diffusion and aggregation of the MAPT association of the actin were indicated by Phalloidin-fluoresceineisothioeyanate(FITC)and immunofluorescence(IF)cyto-chemistry,and observed by the laser-confocal microscopy.ResultsThe MAPT mRNA levels were 0.24±0.04 and 0.52±0.04 at 1 week and 2 weeks after the induction，which were significantly higher compared with those of BMSC(0.04±0.02)after the induction (P＜0.05).The MAPT protein levels were 0.18±0.03 and 0.44±0.05 at 1 week and 2 weeks after the induction,which were significantly higher compared those of BMSC(0.06±0.04,P＜0.05).The distribution patterns of MAPT were changed from the diffusion to the aggregation in cells after treatment by BPV.The nerve-like cells appeared the characteristic of polarization.ConclusionWhen the nerve cells derived from bone marrow stem cells obtain the mature differentiation,PTEN may possess the ability of modulating the diffusion and aggregation of MAPT in vitro,also may provide a kind of material basis for the growth of the nerve axon.

tumor suppressor proteins；tau proteins；cytoskeleton；reverse transcriptase polymerase chain reaction；fluoroimmunoassay;phosphatase and tensin homolog deleted in chronlosome 10

R349.52

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.009

1天津醫(yī)科大學研究生院（郵編300070）；2天津市天津醫(yī)院骨科；3中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院中心實驗室

閆旭（1976），男，副主任醫(yī)師，博士在讀，主要從事神經(jīng)再生研究

△通訊作者E-mail：pumc@sina.com