周志國(guó) 明月梅

（廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000）

SMART技術(shù)構(gòu)建的辣椒疫霉菌與辣椒互作AD-cDNA文庫(kù)

周志國(guó) 明月梅

（廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000）

為了分離和克隆辣椒中疫霉菌誘導(dǎo)基因，以接種辣椒疫霉菌的葉片為材料，利用SMART技術(shù)構(gòu)建辣椒疫霉菌與辣椒互作的雙雜交cDNA文庫(kù)。結(jié)果表明：該文庫(kù)容量為3.6×106cfu，重組率88%左右，插入片段集中在300～2 000 bp之間，平均長(zhǎng)度約為800 bp，表明獲得的文庫(kù)質(zhì)量較高，該文庫(kù)將為分子育種提供重要的基因資源。

辣椒疫霉菌；SMART技術(shù)；雙雜交cDNA文庫(kù)

辣椒是我國(guó)重要的蔬菜和加工原料作物，產(chǎn)值居蔬菜之首（謝思惠 等，2011）。在辣椒生產(chǎn)過程中，病害種類多，發(fā)生頻繁，其中疫?。≒hytophthora blight）是重要的真菌性土傳病害，發(fā)病快，蔓延迅速，病程期短，防治困難（杜曉華 等，2005），常造成辣椒大面積減產(chǎn)甚至絕收，在我國(guó)吉林、遼寧、青海、河北、北京、云南、甘肅、陜西、上海、浙江、湖南、江蘇、江西等地均有發(fā)生（周啟明 等，1984；關(guān)天舒 等，1995；鄒學(xué)校 等，2004）。研究人員已對(duì)辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的生理與致病機(jī)理、辣椒的疫病病理、栽培方式、化學(xué)防治、生物防治等方面進(jìn)行了相關(guān)研究（田林 等，1989；朱英波和李超，2002；李智軍 等，2007；劉學(xué)敏，2007；江厚春 等，2011），但抗病育種作為防治辣椒疫病的重要方法，其抗病資源相對(duì)缺乏（程芳，2007；史云國(guó)，2007；徐劉平和郭堅(jiān)華，2007）。

cDNA文庫(kù)是現(xiàn)代研究功能基因組學(xué)的最有效手段之一，可直接從cDNA文庫(kù)中篩選所需目的基因，并用于基因的表達(dá)分析（Colin et al.，1999；蔡寧波 等，2007；朱利軍 等，2009）。利用SMART技術(shù)（Switching Mechanism At 5′end of RNA Transcript）構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，可從中發(fā)現(xiàn)候選基因，從而在生產(chǎn)上實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用（張沖 等，2013）。為充分開發(fā)和利用辣椒抗病基因，本試驗(yàn)以辣椒為材料，利用SMART技術(shù)構(gòu)建辣椒疫霉菌誘導(dǎo)的混合葉片Y2H的AD-cDNA文庫(kù)，測(cè)定文庫(kù)的滴度和重組率，并隨機(jī)挑選50個(gè)單克隆，對(duì)測(cè)序成功的序列進(jìn)行初步生物信息學(xué)分析。該文庫(kù)為篩選辣椒-疫霉互作蛋白分子基因提供豐富資源，為研究辣椒-疫霉相互作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取8～10葉期的卞椒1號(hào)辣椒無菌苗，接種疫霉菌孢子懸浮液（含游動(dòng)孢子1 000個(gè)·mL-1）2 mL，分別于12、24、48、60、72 h后取樣，液氮凍存，用于RNA提取。

Trizol試劑即TRIzon Reagent（CW0580），購(gòu)自康為世紀(jì)，文庫(kù)構(gòu)建試劑盒Make Your Own“Mate & Plate”Library System User Manual（630490）購(gòu)自Clonetech 公司。

1.2 文庫(kù)的構(gòu)建

1.2.1 高質(zhì)量RNA的提取 采用Trizol法分別提取辣椒疫霉菌誘導(dǎo)的接種12、24、48、60、72 h后葉片的總RNA，具體方法參考說明書CW0580，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，同時(shí)用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的濃度及純度。

1.2.2 cDNA的合成與純化 以Total RNA為模板，參照說明書630490，以CDSIII/6 PCR Primer合成第一鏈，然后以3′PCR Primer和5′PCR Primer為引物通過LD-PCR合成雙鏈cDNA。經(jīng)CHROMA SPIN+TE-400（Clonetech）分離柱去除雙鏈cDNA中200 bp以下短片段。

1.2.3 文庫(kù)的構(gòu)建 將質(zhì)粒載體pGADT7-Rec與純化后的雙鏈cDNA連接，然后轉(zhuǎn)入新鮮制備的酵母感受態(tài)Y187，涂布于100個(gè)SD/-Leu培養(yǎng)基平板，同時(shí)分別吸取1∶100、1∶1 000轉(zhuǎn)化后的Y187細(xì)胞稀釋液100 μL到SD/-Leu平板上，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。4 d后用玻璃珠法，將收集下來的酵母溶于YPDA液體，混勻后與75%的甘油以2 V ∶1 V的比例混合保存于-80 ℃冰箱。

1.3 cDNA文庫(kù)的檢測(cè)

將酵母菌液10 μL稀釋10 000倍后，取出50 μL涂布SD/-Leu平板，培養(yǎng)4 d，計(jì)算文庫(kù)滴度。

文庫(kù)滴度（cfu·mL-1）=平板上的克隆數(shù)/0.05 mL×10-4

庫(kù)容量=文庫(kù)滴度×懸浮體積（mL）

隨機(jī)挑取50個(gè)單菌落，以pGADT7-Rec載體上的引物（參照說明書680490）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后測(cè)序（上海生工生物工程有限公司），在辣椒數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（http：//peppersequence.genomics.cn）對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AD-cDNA文庫(kù)構(gòu)建

2.1.1 RNA質(zhì)量檢測(cè) 提取高質(zhì)量RNA是cDNA文庫(kù)構(gòu)建成功的關(guān)鍵，采用Trizol法分別提取辣椒疫霉菌誘導(dǎo)的卞椒1號(hào)葉片總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可看出，提取的5個(gè)樣品總RNA可見2條清晰的28S、18S RNA條帶，完整性較好（圖1）。經(jīng)核酸蛋白儀測(cè)定（表1），5個(gè)樣品的總RNA均符合文庫(kù)構(gòu)建的要求。將5個(gè)總RNA樣品分別吸取1、0.6、0.5、0.6、0.8μL混勻，用于cDNA的合成。

圖1 辣椒疫霉菌誘導(dǎo)的辣椒葉片總RNA凝膠電泳結(jié)果

表1 RNA質(zhì)量檢測(cè)

2.1.2 cDNA的合成 以CDSIII/6 PCR Primer引物合成cDNA，得到的雙鏈cDNA帶呈彌散狀均勻分布（圖2-a），質(zhì)量完全符合建庫(kù)要求。經(jīng)CHROMA SPIN+TE-400樹脂柱純化后的雙鏈cDNA帶富集在400～3 000 bp（圖2-b），經(jīng)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度均達(dá)到建庫(kù)的要求。

2.2 AD-cDNA文庫(kù)的質(zhì)量鑒定

根據(jù)同源重組的原理，將合成的cDNA和pGADT7-Rec載體共轉(zhuǎn)化酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過SD/-Leu平板篩選，4 d后獲得陽(yáng)性重組子（圖3-a）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，酵母轉(zhuǎn)化液稀釋1 000倍后涂布獲得的重組子數(shù)目為24個(gè)單克隆（圖3-b），文庫(kù)的轉(zhuǎn)化效率為4.8×106cfu·μg-1，高于建庫(kù)要求。文庫(kù)容量 = 24（每皿平均克隆數(shù)）/100 μL× 1 000×15×103μL = 3.6×106cfu。取轉(zhuǎn)化后的酵母菌原液通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，所得文庫(kù)的酵母細(xì)胞濃度為2×108cfu·mL-1，達(dá)到酵母雙雜交所需要的細(xì)胞濃度。

圖2 dsDNA電泳結(jié)果

圖3 文庫(kù)構(gòu)建與質(zhì)量評(píng)估

用玻璃珠法收集文庫(kù)克隆，取收集的文庫(kù)菌液稀釋10 000倍后涂布培養(yǎng)，觀察計(jì)數(shù)（圖4），計(jì)算文庫(kù)滴度=286 cfu/0.05 mL×10-4=5.72×107cfu·mL-1。

圖4 稀釋平板計(jì)數(shù)文庫(kù)滴度

隨機(jī)挑取50個(gè)酵母菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢查文庫(kù)的空載率以及插入片段的平均長(zhǎng)度。其結(jié)果表明，有6個(gè)單克隆未出現(xiàn)條帶，文庫(kù)質(zhì)粒的空載率12%左右，重組率88%，插入片段長(zhǎng)度為300～2 000 bp，平均長(zhǎng)度約為800 bp（圖5）。

圖5 文庫(kù)隨機(jī)菌落PCR電泳檢測(cè)

測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast和DNAMAN多重序列比對(duì)，共有20個(gè)無重復(fù)序列，在辣椒數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì)，共有20組基因，編碼17種已知蛋白，3種未知蛋白（表2）。

表2 文庫(kù)克隆測(cè)序基因

3 結(jié)論與討論

SMART技術(shù)構(gòu)建文庫(kù)操作簡(jiǎn)單，且獲得全長(zhǎng)比例較高。該技術(shù)避免了mRNA在分離純化時(shí)發(fā)生降解和丟失；利用同源重組把外源雙鏈cDNA定向重組到載體上，解決了連接效率低等問題，保證了cDNA文庫(kù)的方向性和完整性（Zhu et al.，2001）。

辣椒基因組測(cè)序已經(jīng)完成，研究人員構(gòu)建了高密度的連鎖圖譜，并組裝得到高質(zhì)量的基因組精細(xì)圖譜，基因組大小約為3.3 Gb，其中約90%的基因都錨定在染色體上（Qin et al.，2014）。本試驗(yàn)所構(gòu)建的辣椒疫霉菌誘導(dǎo)的辣椒葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率約為4.8×106cfu·μg-1，文庫(kù)滴度為5.72×107cfu·ml-1，重組率近90%，插入片段集中在300～2 000 bp之間，平均長(zhǎng)度約為800 bp，達(dá)到了文庫(kù)構(gòu)建要求，還滿足蛋白互作實(shí)驗(yàn)（酵母雙雜交）。通過構(gòu)建誘餌基因載體，可以在較短時(shí)間內(nèi)從AD-cDNA文庫(kù)中篩選出與誘餌基因互作的基因。

cDNA文庫(kù)的重組率、滴度、插入片段的大小及片段完整性是檢測(cè)文庫(kù)的重要指標(biāo)?？俁NA質(zhì)量直接決定cDNA文庫(kù)質(zhì)量的好壞，本文庫(kù)構(gòu)建中選取了條帶清晰，無酚類、蛋白、多糖等污染的RNA樣品，符合構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫(kù)的條件。利用多樣品混合的文庫(kù)來篩選和挖掘誘導(dǎo)相關(guān)基因，可為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗病的新品種辣椒提供豐富的基因資源，為辣椒新品種分子育種奠定基礎(chǔ)。

蔡寧波，黃湘文，莊偉建．2007．花生種子全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和鑒定．花生學(xué)報(bào)，36（2）：1-5．

程芳． 2007．辣椒疫霉病的綜合防治．農(nóng)村科技，（7）：27．

杜曉華，鞏振輝，李大偉．2005．辣椒抗疫病的遺傳與育種．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，14（1）：30-36．

關(guān)天舒，李鳳云，趙奎華，劉長(zhǎng)遠(yuǎn)，苗則彥，喬勇．1995．我國(guó)辣椒疫病的研究現(xiàn)狀．遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，（5）：24-27．

江厚春，朱輝，王滿意，呂國(guó)華，李寶聚．2011．李寶聚博士診病手記（三十三）：辣椒疫病初侵染來源、傳播途徑及防治技術(shù)．中國(guó)蔬菜，（5）：23-25．

李智軍，龍衛(wèi)平，鄭錦榮，雷建軍．2007．廣東辣椒疫霉菌分離鑒定及其致病力和生理小種分化研究．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，28（1）：50-54．

劉學(xué)敏．2007．辣椒疫霉菌侵染模型和侵染條件定量研究．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，18（5）：1061-1065．

史云國(guó)．2007．大棚辣椒疫病的發(fā)生與綜合治理技術(shù)．上海蔬菜，（4）：59-60．

田林，沈克功，王有琪，沈克功，李廷群．1989．甘肅省辣椒疫病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究．科技情報(bào)（蘭州），（2）：11-14．

謝思惠，魏澤平，張永佳，鄭宜清，蘭秀英，曹克友．2011．辣椒種質(zhì)資源與育種研究進(jìn)展．閩東農(nóng)業(yè)科技，（1）：20-25．

徐劉平，郭堅(jiān)華．2007．生防菌NJ02防治辣椒疫霉病效果及對(duì)辣椒根圍微生物群落的影響．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，（1）：59-62．

張沖，蔡鐵城，陳華，曾建斌，莊偉建．2013．青枯菌誘導(dǎo)的煙草葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和初步分析．分子植物育種，11（5）：624-629．

周啟明，李林英，楊淑華．1984．辣椒疫病的調(diào)查研究．中國(guó)蔬菜，（1）：40-43．

朱利軍，長(zhǎng)孫東亭，羅素蘭．2009．全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法及應(yīng)用研究．海南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，27（2）：185-190．

朱英波，李超．2002．辣椒抗疫性組織病理學(xué)初步研究．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，18（5）：55-56．

鄒學(xué)校，戴雄澤，馬艷青，張竹青，劉榮云，陳文超，李雪峰，周群初．2004．湖南辣椒地方品種資源與湘研辣椒品種選育的灰色關(guān)聯(lián)分析．植物遺傳資源學(xué)報(bào)，5（3）：233-238．

Colin P L，Nprris S R，Wheeler G L，Williams E H，Smirnoff N，Last R L．1999．Genetic evidence for the role of GDP-mannose in plant ascorbic acid（vitamin C） biosynthesis ．Proe Natl Acad Sci USA，96：4198-4203．

Qin C，Yu C，Shen Y，et al．2014．Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization．Proceedings of the National Academy of Sciences，111（14）：5135-5140．

Zhu Y Y，Machleder E M，Chenchik A，Li R，Siebert P D．2001．Reverse transcriptase template switching：a SMART approach for full-length cDNA library construction．Biotechniques，30（4）：892-897．

Construction of AD-cDNA Library for Interaction of Phytophthora capsici and Pepper in SMART Technology

ZHOU Zhi-guo，MING Yue-mei
（Life Science Department，Langfang City Normal College，Langfang 065000，Hebei，China）

In order to identify the Phytophthora capsici stress induced genes of pepper， a double-hybrid cDNA library of Phytophthora capsici infected pepper leaves was constructed using SMART technology. The results showed that the cDNA library contained 3.6×106independent clones， and the recombination rate was 88%. Insert fragments ranged from 300 bp to 2 000 bp， and the average length of the library was about 800 bp. These data demonstrate that the library is qualified， and able to provide important genetic resources for molecular breeding.

Phytophthora capsici；SMART technology；Double-hybrid cDNA library

周志國(guó)，男，講師，主要從事蔬菜作物遺傳育種工作，E-mail：zhiguo_zhou@163.com

2015-06-19；接受日期：2015-07-30

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（12226306），河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心項(xiàng)目（YF201411）