喬娜娜 王運(yùn)良

1）濰坊醫(yī)學(xué)院2011級(jí)神經(jīng)病學(xué)研究生 濰坊 261053 2）解放軍第148中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 淄博 255300

姜黃素對(duì)阿爾茨海默病細(xì)胞模型miRNA106a的影響

喬娜娜1）王運(yùn)良2）

1）濰坊醫(yī)學(xué)院2011級(jí)神經(jīng)病學(xué)研究生 濰坊 261053 2）解放軍第148中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 淄博 255300

目的 探討阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）中姜黃素與miR-106a的關(guān)系。方法 將PC12細(xì)胞隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組（PC12細(xì)胞組），模型組（PC12細(xì)胞與濃度為4μg／mL的Aβ1-42共培養(yǎng)24h），anti-miR-106a組（造模成功后轉(zhuǎn)染anti-miR-106a），姜黃素組（造模成功后加姜黃素，終濃度為20μmol／L）、共同作用組（anti-miR-106a加入姜黃素）。RT-PCR檢測(cè)miR-106a的含量；Western blotting檢測(cè)APP的含量。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組和anti-miR-106a組miR-106a含量均明顯降低（P＜0.05），而姜黃素組明顯升高（P＜0.05）。Western blotting結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組（P＜0.05）和anti-miR-106a組（P＜0.01）APP明顯增加，姜黃素組APP比模型組明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論 姜黃素可通過(guò)正性調(diào)節(jié)miR-106a而參與AD的治療。

姜黃素；miR-106a；anti-miR-106a；阿爾茨海默病

阿爾茨海默?。ˋD）是一種老年性神經(jīng)變性疾病，病情進(jìn)行性加重，主要表現(xiàn)病理為細(xì)胞外淀粉樣沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元缺失。Aβ（β-amyloid protein，Aβ）沉積被認(rèn)為是AD的始發(fā)因素［1］。Aβ是經(jīng)APP轉(zhuǎn)化而來(lái)，APP是一種廣泛存在于全身組織細(xì)胞、具有膜受體蛋白樣的跨膜糖蛋白，表達(dá)增加會(huì)加重AD的發(fā)生。近年來(lái)微小RNA（microRNA，miRNA）對(duì)AD的作用引起人們的廣泛關(guān)注而成為研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA106a［2］在AD患者含量降低約50％，且能夠上調(diào)APP mRNA的表達(dá)，增加APP的產(chǎn)生，利于AD的發(fā)生。如果能減少轉(zhuǎn)化為Aβ的APP的產(chǎn)生，在某些程度能夠減少Aβ的產(chǎn)生和沉積，從而減緩AD的發(fā)生。

在AD治療的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)酚性色素姜黃素可能對(duì)AD的治療有幫助。姜黃素最初作為一種食物廣泛用于印度等亞洲國(guó)家人們的生活中，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在70～79歲的印度老年人AD的發(fā)病率較同齡歐美人低4.4倍。根據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道，迄今為止臨床及實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用姜黃素尚未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，因而與非甾體抗炎藥和其他抗氧化藥物相比，姜黃素有可能成為治療AD的安全、有效的新舉措之一。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能抑制Aβ的產(chǎn)生，但這種抑制作用是否與miRNA106a降低相關(guān)還不清楚。基于以上原因，我們對(duì)姜黃素與miRNA106a的關(guān)系進(jìn)行探討，目的是探索姜黃素對(duì)AD的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 PC12細(xì)胞（腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞），由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)。細(xì)胞在含5％胎牛血清、10％馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放在5％進(jìn)行CO2、37℃的培養(yǎng)箱，隔天半量換液，當(dāng)細(xì)胞融合度＞80％時(shí)接種傳代。按2×105個(gè)／mL的密度接種在96孔板中，按5×104個(gè)／mL的密度接種在24孔板中，貼壁生長(zhǎng)12h后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，以細(xì)胞圓形、貼壁較好，顯微鏡下細(xì)胞透亮度可的細(xì)胞為正常細(xì)胞，可以用于實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)（按隨機(jī)數(shù)字表法）分為正常對(duì)照組、模型組、anti-miR-106a組、姜黃素組和共同作用組，每組6個(gè)復(fù)孔。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 Aβ1-42、姜黃素、DMSO溶液、2.5％胰酶、4％多聚甲醛、Lipofectamine 2000（Sigma公司）、DMEM、胎牛血清、馬血清（GIBCO公司）、DAB顯色液（北京索萊寶科技有限公司）、PCR試劑盒、CCK-8試劑（Invitrogen公司）、anti-miRNA106a（南京金思特科技有限公司）、APP抗體（北京中杉金橋）。

1.3 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（HSX-150，上海）、倒置顯微鏡（尼康Ti-E／U／S，日本）、多功能酶標(biāo)儀（Berthold，德國(guó)）、離心機(jī)（CHRIST，德國(guó)）、凝膠成像系統(tǒng)（analytikjena，德國(guó)）、熒光定量PCR儀（Eppendorf公司，德國(guó)）。

1.4 細(xì)胞模型的建立 首先用無(wú)菌蒸餾水將粉末狀的Aβ1-42溶解，配成5mg／mL，密封后-20℃保存。使用前用1×PBS稀釋成1mg／mL，于37℃培養(yǎng)箱中孵育24h，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的Aβ1-42。然后用微量加樣器加入Aβ1-42（終濃度為4μg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.5 分組及處理 正常對(duì)照組：PC12細(xì)胞正常培養(yǎng)；B模型組：加入Aβ1-42使終濃度為4μg／mL培養(yǎng)24h；anti-miR-106a組：Aβ1-42培養(yǎng)24h后按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA106a；姜黃素組：Aβ1-42培養(yǎng)24h后加入姜黃素（終濃度為20μmol／L）培養(yǎng)48h；共同作用組：姜黃素和anti-miR-106a同時(shí)作用與模型組。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)：觀察96孔板中PC12細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后放于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量。

1.6.2 RT-PCR檢測(cè)miR-106a水平：檢測(cè)24孔板中PC12細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后吸出培養(yǎng)基，利用RNA提取試劑盒一步法提取總RNA，建立熒光定量PCR反應(yīng)體系，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增后檢測(cè)使用凝膠分析系統(tǒng)軟件掃描，以各條帶的灰度值／內(nèi)參照灰度值的比值進(jìn)mRNA表達(dá)的半定量分析。其中miR-106a上游引物序列CGGCAAAGTGCTAAC AGT，下游引物序列GTGCAGG GTCCGAGGT；U6內(nèi)參上游引物序列ATTGGAACGATACAGAGAAG ATT，下游引物序列GGAACGCTTCA CGAATTTG。反應(yīng)條件：95℃30min，92℃12s，62℃55s，40個(gè)循環(huán)，熒光定量RQ＝2-△△CT計(jì)算。1.6.3 Western blot方法檢測(cè)APP水平：抽提PC12細(xì)胞，用RIPA裂解液（50mM Tris-HCl（pH 7.4），150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS）在冰上裂解，離心取上清液即蛋白質(zhì)，按照Western blot說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其中一抗為兔抗鼠APP，二抗為山羊抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶抗體，應(yīng)用LAS-4000型熒光／化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯像，通過(guò)計(jì)算APP與β-actin光密度的比值反映各組中APP的表達(dá)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖表繪制由Excel2003統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 PC12細(xì)胞觀察及活性檢測(cè) 培養(yǎng)PC12細(xì)胞，接種12h后細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞圓形飽滿，透光度好。加入已孵育好的終濃度為4μg／mL的Aβ1-42處理24h后，可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量減少、體積變小、貼壁性減弱，懸浮細(xì)胞較多；anti-miR-106a 組PC12細(xì)胞基本同模型組；姜黃素組中PC12細(xì)胞數(shù)量明顯增加，形態(tài)飽滿；共同作用組細(xì)胞數(shù)量介于姜黃素組合模型素組之間，部分細(xì)胞細(xì)胞膜出現(xiàn)皺縮。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組中PC12細(xì)胞顯微鏡下觀察

A（正常對(duì)照組）中細(xì)胞數(shù)量較多，貼壁較好，形態(tài)飽滿；B（模型組）中細(xì)胞數(shù)量減少，體積減小，細(xì)胞膜出現(xiàn)皺縮；C（anti-miR-106a組）中細(xì)胞與模型組中差別不大；D（姜黃素組）中細(xì)胞數(shù)量較正常對(duì)照組稍多，形態(tài)相似；E（共同作用組）中細(xì)胞數(shù)量介于圖片B、E中細(xì)胞數(shù)量之間，部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜皺縮

2.2 各組PC12細(xì)胞miR-106a檢測(cè)RT-PCR檢測(cè) 各組中miR-106a，與正常對(duì)照組miR-106a相比，模型組和anti-miR-106a組均明顯降低（P＜0.05），而姜黃素組明顯升高（P＜0.01），共同作用組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組PC12細(xì)胞中miR-106a相對(duì)值

2.3 細(xì)胞APP水平檢測(cè) 與正常對(duì)照組APP相比，模型組（P＜0.05）和anti-miR-106a組明顯增加（P＜0.01），姜黃素組APP與模型組相比明顯降低（P＜0.01），共同作用組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組PC12細(xì)胞中APP相對(duì)值

3 討論

阿爾茨海默病是老年癡呆發(fā)病率最高的疾病，預(yù)計(jì)2050年以后，全球阿爾茨海默病的患病率是目前的4倍，嚴(yán)重危害老年人身心健康，也給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。在對(duì)AD患者的研究中，發(fā)現(xiàn)許多miRNAs參與了APP和淀粉樣前體蛋白裂解酶1（BACE1）表達(dá)的調(diào)節(jié)，在AD患者腦中含量降低。尸檢分析顯示，AD大腦中BACE1表達(dá)上調(diào)是在蛋白質(zhì)水平，而不是在mRNA水平［3］。轉(zhuǎn)基因小鼠過(guò)表達(dá)miR-29c可減少BACE1蛋白的水平［4］。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)miRNA的表達(dá)與AD發(fā)病因果關(guān)系提供了支持，不難想象特異性miRNA的缺失可導(dǎo)致散發(fā)性AD患者腦組織BACE1和Aβ表達(dá)增加，直接通過(guò)毒性Aβ的形成，參與AD的發(fā)病機(jī)制。由此可見(jiàn)，AD的發(fā)病與異常表達(dá)的miRNA密切相關(guān)。如果某種藥物能夠有效調(diào)節(jié)正常人中miRNA的表達(dá)，或是調(diào)節(jié)AD患者miRNA的表達(dá)趨于正常，將對(duì)AD領(lǐng)域的預(yù)防或治療產(chǎn)生不可估量的影響。

本實(shí)驗(yàn)著重于對(duì)姜黃素作用的研究，實(shí)驗(yàn)室前期已完成姜黃素干預(yù)AD動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)［5］，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠調(diào)節(jié)海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）以及調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2，塌陷反應(yīng)介導(dǎo)蛋白-2（CRMP-2）、P-CRMP-2及軸突蛋白的表達(dá)。Ahmed等［6］在實(shí)驗(yàn)中也同樣發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠明顯降低海馬中膠質(zhì)纖維酸性蛋白、caspase-3的水平，說(shuō)明姜黃素在炎癥和凋亡層面上參與AD的治療。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，miR-106a表達(dá)與APP呈負(fù)相關(guān)，姜黃素能夠調(diào)節(jié)miR-106a含量增加，減少APP產(chǎn)生，而在anti-miR-106a存在的情況下，姜黃素的這種作用幾乎完全喪失，說(shuō)明姜黃素對(duì)APP的調(diào)節(jié)是通過(guò)調(diào)節(jié)miR-106a來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

我們的實(shí)驗(yàn)也存在某些局限，首先姜黃素的低水溶性對(duì)實(shí)驗(yàn)有一定程度的限制，可以采用姜黃素類(lèi)似物解決溶解度問(wèn)題；其次是設(shè)立的姜黃素濃度組較少，對(duì)姜黃素的最佳濃度缺乏進(jìn)一步研究；最后，如果有miR-106a促進(jìn)劑的加入，能夠促進(jìn)姜黃素的作用，將更能表明姜黃素在AD中對(duì)miR-106a的調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)姜黃素治療AD的說(shuō)服力。

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（收稿2014-05-12）

Effects of curcumin on miRNA106a in the cell model of Alzheimer＇s disease

Qiao Nana*，Wang Yunliang
*The Class of2011 Neurology Graduate Student of Weifang Medical School，Weifang201053，China

Objective To investigate the relationship between curcumin and miR-106ain Alzheimer's disease.Methods PC12cells were randomly divided into 5groups，namely，normal control group，model group（cultured with 4μg／mL Abeta1-42for 24hours），anti-miR-106agroup（transfected with anti-miR-106a），curcumin group（adding 20μmol／L curcumin）and coaction group（adding curcumin and anti-miR-106a）.The miR-106acontent of each group was detected by RT-PCR and APP content was detected by Western blotting.Results RT-PCR showed that the concentration of miR-106adecreased significantly in model group and anti-miR-106agroup but increased markedly in curcumin group compared with normal control group.Western-blotting showed that the APP content increased significantly in APP model group and anti-miR-106agroup but decreased markedly in curcumin group compared with normal control group.Conclusion Curcumin maybe positively regulate miR-106ain alzheimer's disease.

Curcumin；miR-106a；Anti-miR-106a；Alzheimer's disease

R749.1+6

A

1673-5110（2015）02-0041-03