楊東璇，肖鵬飛

(1.北京科技大學(xué) 土木與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

白腐真菌對氯丹污染土壤的生物修復(fù)研究

楊東璇1，肖鵬飛2

(1.北京科技大學(xué) 土木與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

在實驗室模擬條件下，研究了白腐真菌Phlebia lindtneri GB1027對有機氯農(nóng)藥氯丹污染土壤的修復(fù)作用及影響因素。結(jié)果表明，白腐真菌在土壤中較少受到土著微生物的競爭影響，在滅菌和未滅菌土壤中對氯丹的去除率相差不大。木屑、秸稈和馬鈴薯均可作為營養(yǎng)物和生長載體促進白腐真菌對土壤中氯丹的降解，其中木屑的強化效果最佳，其次為秸稈。本試驗條件下，白腐真菌接種量越大，對氯丹的去除效果越好，當接種量為15～20mL時生物修復(fù)效率最高。在氯丹濃度為5～100mg/kg的污染土壤中，菌株均顯示出較好的修復(fù)效果，尤其對100mg/kg的氯丹的30d平均降解速率達到最高的1.71mg/(kg·d)。菌株對土壤溫度和pH具有較寬的適應(yīng)范圍，污染土壤生物修復(fù)的最適溫度范圍是25～35℃，最適pH范圍是4.0～6.0。本研究結(jié)果表明該白腐菌株具有應(yīng)用于氯丹污染場地修復(fù)的潛力。

我國在上世紀曾大量生產(chǎn)并使用氯丹，雖然在上世紀80年代禁止其在農(nóng)業(yè)上的使用，但仍然生產(chǎn)氯丹用于南方的白蟻防治。截止到2004年，我國共累計生產(chǎn)氯丹達到9 000t，其中1995～2004年十年間共生產(chǎn)氯丹5 400t[1]。為了履行《斯德哥爾摩公約》，我國關(guān)閉了大批氯丹等有機氯農(nóng)藥的生產(chǎn)企業(yè)，而企業(yè)原址在二次開發(fā)過程中，企業(yè)生產(chǎn)遺留下的污染場地的處理則成為了亟待解決的難題。有研究表明，氯丹生產(chǎn)車間表土中氯丹的濃度高達2 927.95mg/kg，且可通過遷移、擴散污染周圍環(huán)境[2]。氯丹在土壤中殘留期長、生物毒性強，如不對污染場地進行及時、有效地治理，將會對生態(tài)環(huán)境和人群健康造成潛在的威脅。

目前國內(nèi)對于氯丹污染土壤的修復(fù)研究雖已有開展，但主要集中在微波修復(fù)[3-4]和淋洗修復(fù)[5-6]兩類方法。生物修復(fù)技術(shù)因其成本低、無二次污染、環(huán)境友好等特點，成為有機污染土壤修復(fù)的關(guān)鍵技術(shù)[7]，但目前國內(nèi)缺乏氯丹等有機氯農(nóng)藥污染土壤的生物修復(fù)研究。白腐真菌是一類能有效降解木素的絲狀真菌，其降解酶系特異性較低，對多種難降解有機污染物都顯示出一定的降解效果，使其在生物修復(fù)中具有良好的應(yīng)用前景[8]。近年來，本課題組以白腐真菌為降解菌，在有機氯農(nóng)藥的生物降解方面開展了一些研究，發(fā)現(xiàn)部分白腐真菌及其酶系能在液相體系中高效降解氯丹，并將其轉(zhuǎn)化為脫氯及羥基化產(chǎn)物，顯示出一定的生物修復(fù)潛力[1,9-10]。應(yīng)用微生物修復(fù)受污染環(huán)境需考慮諸多環(huán)境因子的影響，如共存微生物的競爭作用、接種量、污染物濃度、營養(yǎng)物質(zhì)、溫度及pH等，這些因素直接影響污染土壤的生物修復(fù)效率。本文針對國內(nèi)對氯丹等有機污染土壤修復(fù)技術(shù)的需求，在前期研究的基礎(chǔ)上，擬進一步考察白腐真菌對氯丹污染土壤的修復(fù)效果及影響因素，探討白腐真菌應(yīng)用于生物修復(fù)的可行性，為完善污染土壤的修復(fù)技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤：在東北林業(yè)大學(xué)林場采集表層黑土土壤樣品，去除根莖、敗葉、碎石等雜物，室內(nèi)自然風(fēng)干、研磨，過60目篩，備用。經(jīng)測定，土壤中有機質(zhì)含量為35.23g/kg，pH值為6.6，粘粒、粉粒和砂粒所占比例分別為63.2％、32.1％和4.7％。土壤中未檢測出順式或反式氯丹。

菌株及培養(yǎng)基：所用白腐真菌菌株P(guān)hlebia lindtneri GB1027由日本九州大學(xué)農(nóng)學(xué)院近藤研究室提供。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉15g/L；馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)：馬鈴薯浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖15g/L，氯化鈉5g/L。

1.2 菌株培養(yǎng)

實驗前，將在4℃斜面保存的菌種接種于含有15mL PDA固體培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿中，30℃擴增培養(yǎng)5～6d，待長出的白色菌絲長滿整個PDA培養(yǎng)基表面，將菌絲體刮下接種到無菌水中，輕輕振蕩分散形成乳白色的孢子懸浮液并于4℃保存待用。取孢子懸浮液2mL接種于300mL的PDB液體培養(yǎng)基中，在氣浴恒溫振蕩器上以30℃、150r/min下活化培養(yǎng)，定期注入氧氣。定期用平板計數(shù)法測定菌懸液中的孢子數(shù)，達到每毫升106個時即可進行降解試驗。

1.3 降解試驗

稱取20g土壤裝入200mL錐形瓶，用噴霧法加入一定量配制好的反式氯丹的甲醇溶液，用無菌玻璃棒攪勻后制成人工模擬污染土壤，使氯丹初始濃度為50mg/kg。取其中部分錐形瓶于高溫滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌40min，冷卻后在無菌室內(nèi)按上述方法配制氯丹污染土壤。將錐形瓶置于室內(nèi)使溶劑自然風(fēng)干并放置2周后備用。土樣中均勻添加5g木屑作為白腐真菌生長碳源和載體，并用以調(diào)節(jié)土壤空隙度。無菌條件下將上述培養(yǎng)好的菌懸液15mL接種到錐形瓶中。向錐形瓶通氧30s后密封，30℃條件下避光靜置培養(yǎng)30d，定時補充水分以保持土壤含水率。每5d取樣測定土壤中氯丹濃度。對照試驗中接種的菌懸液預(yù)先進行高溫滅菌處理(121℃、20min)，其他條件相同。實驗結(jié)束后將土壤風(fēng)干，4℃保存，待測。

1.4 降解條件試驗

本試驗設(shè)5個調(diào)控因子：菌懸液的接種量分別為2、5、10、15、20mL；共代謝底物選擇木屑、粉碎秸稈或馬鈴薯塊(0.5cm×0.5cm)；氯丹初始濃度分別為5、10、20、50和100mg/kg；溫度分別設(shè)定為20、25、30、35和40℃；土壤pH分別設(shè)定為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0。以上每個處理做2個平行，試驗重復(fù)2次。

1.5 樣品處理與測定

取處理后的土壤樣品置于索氏提取器中，錐形瓶用少量二氯甲烷清洗并倒入索氏提取器。加入200mL的二氯甲烷浸泡過夜后加入回收指示物，恒溫水浴鍋上連續(xù)提取12h。轉(zhuǎn)移提取液并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40℃下濃縮至近干，加入10mL正己烷以轉(zhuǎn)換溶劑，進一步濃縮至2ml左右。通過硅膠/氧化鋁層析柱進行分離凈化，層析柱規(guī)格為25cm×1cm內(nèi)徑的玻璃柱，柱上層加有無水硫酸鈉用以除水。樣品上柱后，依次用15mL正己烷和70mL二氯甲烷/正己烷(3∶2，體積比)淋洗，將淋洗液混合并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，置換溶劑為正己烷，用高純氮氣定容至0.5mL，轉(zhuǎn)移至樣品瓶中待測。

采用HP6890-HP5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對氯丹進行定量測定。氣相色譜柱為DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)。載氣為高純氦氣，流量為1mL/min。進樣口溫度250℃，不分流進樣，進樣量1μL。升溫程序為：起始溫度80℃，保持2min后以15℃/min升至220℃，再以10℃/min升至300℃，保持2min。白腐真菌對氯丹的降解率計算公式為：降解率％=(對照土壤中氯丹的濃度-白腐真菌處理后土壤中氯丹的濃度)×100/土壤中氯丹的起始濃度

2 結(jié)果與分析

2.1 白腐真菌對滅菌和未滅菌土壤中氯丹的降解

為考察土著微生物對接種白腐真菌修復(fù)氯丹污染土壤的影響，研究了滅菌和未滅菌土壤中接種菌懸液對氯丹(50mg/kg)的降解情況。如圖1所示，在滅菌土壤中，對照處理中氯丹濃度未顯示出明顯變化，避光、封閉處理條件也盡可能避免了氯丹的光解及揮發(fā)損失；而在接種白腐真菌處理中，氯丹的濃度隨處理時間逐漸下降，但在前10d的降解率很低，說明白腐真菌需要自身調(diào)整來適應(yīng)污染物的脅迫。經(jīng)過適應(yīng)期后，降解率逐漸增加，第20d和第30d的氯丹殘留濃度分別只有30.2mg/kg和21.5mg/kg。在未滅菌土壤中，對照處理中氯丹濃度雖然呈現(xiàn)先不變后下降的趨勢，但降解速度十分緩慢，至第30d仍有45.1mg·kg-1的氯丹殘留在土壤中，表明在氯丹的脅迫下土著微生物產(chǎn)生了微弱的降解能力；而加菌處理后，土壤中氯丹的總濃度下降明顯，但在處理前期，氯丹殘余濃度卻高于同一時間滅菌土壤中的濃度，這可能是接種菌作為外源微生物，與土著微生物之間產(chǎn)生的競爭作用，導(dǎo)致生理活性及降解效率受到一定程度的影響所致。然而，處理25d后，殘余氯丹總濃度開始低于滅菌土壤，處理30d時的殘留氯丹濃度只有19.3mg/kg，低于滅菌土壤處理的21.5mg/kg?？梢婋S著處理時間的延長，土著微生物對白腐真菌降解氯丹的影響程度并不大。為了考察P.lindtneri GB1027在污染土壤修復(fù)中的作用，采用滅菌土壤進行后續(xù)研究。

圖1 白腐真菌對滅菌和未滅菌土壤中氯丹的降解Fig.1 Degradation of chlordane by white rot fungus in the sterilized and uns-terilized soils

2.2 添加營養(yǎng)物的影響

分別選擇木屑、粉碎秸稈及馬鈴薯塊作為白腐真菌的營養(yǎng)物摻入土壤，考察其對氯丹污染土壤生物修復(fù)的強化效果。從圖2可見，對照處理中，氯丹的降解速度較慢，處理一個月后僅僅13.4％的氯丹被白腐真菌所降解。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，對照處理中的土壤更容易板結(jié)成塊，不利于為白腐真菌提供有利的生存條件。添加三種營養(yǎng)物的土壤中，氯丹降解速率明顯加快，添加木屑、粉碎秸稈及馬鈴薯的處理體系中氯丹的降解率在第30d分別達到了58.6％、54.3％和35.7％，尤其是木屑和秸稈更能強化土壤中氯丹的白腐真菌降解。相比于馬鈴薯塊，木屑和碎秸稈可以疏松土壤，增加土壤的透氣性，有利于菌絲的生長及對土壤顆粒上氯丹的吸附降解。而在處理前期，木屑對白腐菌修復(fù)作用的促進效果則明顯強于另兩種營養(yǎng)物，表明木屑更加有利于土壤中白腐真菌的生長，從而有利于氯丹的去除。

圖2 幾種營養(yǎng)物對土壤中氯丹生物降解的影響Fig.2 Effects of wood dust,straw and potato on biodegradation of chlordane in soil

白腐真菌對營養(yǎng)物的要求不高，木屑、玉米芯、稻草、秸稈等廉價農(nóng)業(yè)廢棄物都可作為營養(yǎng)源支持其生長[11]。有研究表明，相比于培養(yǎng)在添加馬鈴薯成分的液體培養(yǎng)基，在添加了木材成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)白腐真菌時幾乎很少發(fā)生染菌的情況[12]。白腐真菌擔子果大多在森林土壤中的腐朽木材上生長，木材既可作為白腐真菌的生長載體，又能提供白腐真菌生長所需成分，同時提高了白腐真菌在與其它微生物共存時的競爭能力。因此，在實際應(yīng)用中，考慮修復(fù)效率與成本，使用木屑作為營養(yǎng)物強化白腐真菌修復(fù)污染土壤是比較理想的。

2.3 接種量的影響

接種量是決定生物修復(fù)效率的關(guān)鍵因素之一。外源微生物接種到土壤中會受到很多威脅，如與土著菌的生存競爭，受原生動物的吞食等，導(dǎo)致降解菌數(shù)量的減少。合適的接種量可以建立降解菌數(shù)量上的優(yōu)勢，提高土壤修復(fù)的效率[13]。本研究中，向污染土壤中分別接種2、5、10、15、20mL的菌懸液，考察不同白腐真菌接種量對修復(fù)氯丹污染土壤的影響。結(jié)果如圖3所示，不同接種量的白腐真菌對土壤中的氯丹都具有一定的降解作用，但降解效果有所不同。在接種量為2和5mL時，處理前期由于接種量少，氯丹降解速率較慢，處理后期降解速率加快，在第30d時的降解率分別達到22.5％和29.7％。而隨著接種量的增大至10和15mL，氯丹降解速率明顯加快，30d降解率分別達到了42.1％和54.3％。研究表明，高的接菌量可保證足夠的存活率和一定的種群水平，起到快速降解的效果。當接種量進一步增至20mL時，降解效果和接種量為15mL時相比增加不多。這是由于當接種量達到一定程度時，菌體與底物已經(jīng)充分接觸，此時接種量已近飽和，不再是制約氯丹降解的主要因素。若繼續(xù)增加接種量可能會導(dǎo)致種間競爭，出現(xiàn)營養(yǎng)不足的現(xiàn)象，一定程度上影響降解效果。因此，該試驗條件下接種量控制在15mL左右對于發(fā)揮降解菌的修復(fù)效果是比較合適的。

圖3 菌液接種量對土壤中氯丹生物降解的影響Fig.3 Effects of inoculum amount on biodegradation of chlordane in soil

2.4 氯丹初始濃度的影響

在其它試驗條件相同的情況下，考察了白腐真菌對不同濃度氯丹污染土壤的修復(fù)效果。結(jié)果如圖4所示，在所有初始濃度條件下氯丹殘余濃度均隨時間而有所下降，且呈現(xiàn)出近似線性的變化。在氯丹初始濃度分別為5、10、20、50和100mg/kg時，處理30d后的降解率分別達到72.0％、67.0％、69.5％、57.6％和48.3％；而平均降解速率分 別 為 0.12、0.23、0.51、1.06 和1.71mg/kg·d。從降解率上看，當氯丹初始濃度在5～20mg/kg時的降解率明顯高于50和100mg/kg時的降解率。在菌株接種量一定的條件下，底物濃度較低時，絕大多數(shù)的底物都會迅速與菌體接觸，從而被吸附、降解；隨著底物濃度的升高，底物分子會競爭性地與降解酶活性中心相結(jié)合，使部分底物被排除在外，導(dǎo)致降解速度有所減緩，這可能是氯丹初始濃度較高時降解率降低的原因。然而，在高濃度污染場地修復(fù)過程中，污染物的平均去除速率和去除總量是評價修復(fù)效率的重要指標。在本研究中，無論是氯丹的平均降解速率還是降解總量，在試驗濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出隨初始濃度的增加而增加的趨勢，即在100mg/kg時最高。因此，如果延長處理時間，仍可將殘余在土壤中的氯丹進一步降解去除。以上結(jié)果可見，在該處理條件下，白腐真菌不僅能有效去除土壤中低濃度的氯丹，對高濃度氯丹也有較好的降解去除效果。

圖4 初始濃度對土壤中氯丹生物降解的影響Fig.4 Effects of initial concentration on biodegradation of chlordane in soil

2.5 土壤溫度的影響

在生物修復(fù)過程中，溫度條件直接影響著微生物的生長及降解酶的活性，進而影響著對污染物的降解去除效果。因此，選擇合適的土壤溫度對于提高污染土壤的修復(fù)效率至關(guān)重要。本文研究了不同溫度條件下白腐真菌對土壤中氯丹的降解情況(圖5)。結(jié)果顯示，在25～35℃范圍內(nèi)，氯丹的降解效果較好，30d的降解率均超過了53.5％。30℃處理時對氯丹污染土壤的修復(fù)效果最佳，接近60％。在20～30℃范圍內(nèi)，氯丹的降解率隨溫度升高逐漸升高；而30～40℃范圍內(nèi)，氯丹的降解率隨溫度升高逐漸下降。不同溫度條件下的降解效果雖然有所差別，但從降解曲線可見，降解率在不同溫度間的變化幅度較緩，即使在20℃和40℃時，土壤中氯丹的降解率仍能保持在45％左右，可見該白腐真菌對土壤溫度的適應(yīng)范圍較大，具備野外污染場地的修復(fù)潛力。

圖5 溫度對土壤中氯丹生物降解的影響Fig.5 Effects of temperature on biodegradation of chlordane in soil

2.6 土壤pH值的影響

同溫度條件一樣，土壤pH值也是影響生物修復(fù)過程中微生物及其酶活性的關(guān)鍵因素之一。試驗結(jié)果顯示(圖6)，土壤pH值在4.0～6.0范圍內(nèi)時，氯丹的降解率保持在較高的水平，30d降解率均在56.7％以上，表明在該白腐真菌在弱酸條件下對氯丹的降解活性較強。該菌株的最適pH值為5.0，處理30d后氯丹的降解率達到59.3％。當pH值達到7.0和8.0時，氯丹的降解率分別降至50.9％和44.6％，可見在中性及堿性條件下不太適合菌株發(fā)揮最佳的降解效果。這可能是由于不適的土壤pH值使微生物的生長受到抑制，或使降解酶分子構(gòu)型發(fā)生變化，導(dǎo)致降解活性下降。但總體來說，降解菌對土壤pH值的變化具有一定的適應(yīng)能力，即使在pH值為8.0時，氯丹的降解效果仍可維持在最適pH值條件下的75％左右，即該試驗菌株具備在不同酸堿度條件下修復(fù)氯丹污染土壤的能力。有研究表明[14]，白腐真菌在生長過程中具有調(diào)節(jié)pH值的能力，即使在非最佳生長pH值條件下，也能通過自身的生理功能分泌一些酸堿性物質(zhì)來調(diào)節(jié)土壤pH值，使其達到適于自身生長的范圍。

圖6 pH對土壤中氯丹生物降解的影響Fig.6 Effects of pH on biodegradation of chlordane in soil

3 結(jié) 論

(1)白腐真菌P.lindtneri GB1027在滅菌土壤和未滅菌土壤中都能有效地降解氯丹，且在30d內(nèi)降解率相差不大，表明該菌株能克服土著微生物的競爭效應(yīng)，用于處理受氯丹污染的土壤是可行的。

(2)木屑和秸稈相比于馬鈴薯更適合作為白腐真菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)及生長載體，促進對土壤中氯丹的降解，尤其是木屑的強化效果最好；本試驗條件下，菌液接種量為15mL時對污染土壤的修復(fù)效果最好，繼續(xù)增加接種量對修復(fù)作用的強化效果不明顯；經(jīng)過30d處理，菌株對土壤中濃度為5～100mg/kg的氯丹均具有較好的降解去除效果，初始濃度為最高的100mg/kg時，平均降解速率達到最高的1.71mg/kg·d。

(3)白腐真菌修復(fù)氯丹污染土壤的最適溫度范圍是25～35℃，最適pH值范圍是4.0～6.0；雖然溫度和pH值對修復(fù)效率有一定的影響，但菌株對土壤溫度和pH值具有較寬的適應(yīng)范圍，具有適用于污染場地修復(fù)的潛力。

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Bioremediation of chlordane-contaminated soil by white rot fungus

YANG Dong-xuan1,XIAO Peng-fei2
(1.School of Civil and Environmental Engineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083 China; 2.College of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,Heilongjiang,China)

The bioremediation of chlordane-contaminated soil by white rot fungus Phlebia lindtneri GB1027 and the factors affecting the remediation capacity were investigated under the lab.simulated conditions.In sterilized soil,the degradation rate of chlordane after 30 days of incubation was similar to that those in un-sterilized soil.The removal of chlordane by fungus from soil could be effectively enhanced by addition of wood dust,crushed straw and potato,and the sequence of removed rates was wood＞straw＞potato.The removal rates of chlordane from soil increased gradually with the increase in inoculum amount of P.lindtneri GB1027,and the higher removal rates of chlordane were found from soil with a high inoculum amount of 15～20mL.The strains all showed good repair results in the chlordane-contaminated soil with contaminated concentrations(5～100mg/kg),and the greatest degradation rate of chlordane was 1.71mg/(kg·d)with initial chlordane concentration of 100mg/kg after 30 days.P.lindtneri GB1027 had higher degradation rates(53.5％～59.3％)when the temperature ranged from 25 to 35℃,and the pH value ranged from 4.0 to 5.0.The results indicate that the strains have the potential to apply to chlordane contaminated sites remediation.

white rot fungus; chlordane; chlordane-contaminated soil; bioremediation

S718.51+6

A

1673-923X(2015)07-0105-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.03.019

2014-01-10

國家自然科學(xué)基金項目(41201307)；人社部留學(xué)回國人員科技活動擇優(yōu)資助項目

楊東璇，主要從事環(huán)境工程方面的研究

肖鵬飛，博士，E-mail：xpfawd@nefu.edu.cn

楊東璇,肖鵬飛.白腐真菌對氯丹污染土壤的生物修復(fù)研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2015,35(3)：105-109,114.

[本文編校：吳 毅]