宋 臻

（亞翔系統(tǒng)集成科技（蘇州）股份有限公司，江蘇 蘇州 215000）

引言

胞苷二磷酸膽堿（CytidineDiphosphateCholine，分子結構式見圖1，別名胞磷膽堿或CDPC）是卵磷脂生物合成重要的中間產物。卵磷脂是細胞膜的重要組成成分，它的代謝正常與否直接影響細胞的通透性、能量代謝以及蛋白質生物合成等許多生物學功能。1963年，CDPC開始用于臨床。實踐證明，它對腦損傷引起的意識障礙以及其他神經系統(tǒng)疾病都有較好的療效，隨著社會的發(fā)展，CDPC更是作為預防老年癡呆的保健品得到大力的發(fā)展[1]。

圖1 CDPC分子結構

由于CDPC的廣泛應用，其市場需求量正逐步擴大，2007年，根據(jù)有關機構調查，CDPC在中國市場的年需求大約為250 t，但當年的供給量不足60 t，有著極大的需求缺口。因此，如何高效率、高質量、低成本的生產CDPC成為企業(yè)亟待解決的問題。

將灌流系統(tǒng)應用在CDPC生產中，可以大幅提高產品質量和產量產能，降低產品成本，進而快速填補市場的缺口，增加企業(yè)市場競爭力和企業(yè)效益。

1 胞磷膽堿的生產方法

1.1 胞磷膽堿生產方法簡介

胞磷膽堿的生產方法主要有化學合成法、酶轉化法、雙菌發(fā)酵法和酵母發(fā)酵法?；瘜W合成法是利用化工原料，經過逐級多步反應，再經提純得到最終產品。這種方法研發(fā)成功早，但缺點很多，目前只有少數(shù)企業(yè)在利用此法生產。90年代后日本研發(fā)成功并開始采用酵母酶轉化法生產胞磷膽堿，此法并非無菌發(fā)酵反應，它是利用廢舊酵母的多酶體系將胞苷酸（CMP）和輔料合成CDPC，但由于當時主要原料CMP的價格比較高，此法在當時未得到廣泛發(fā)展。2003年以后，由于CDPC的主要原料CMP的生產技術已經成熟，CMP價格大幅下降，加之經過優(yōu)化后轉化率大幅提高，我國開始大量采用酵母酶轉化法生產CDPC，目前市場大部分產品都由此法生產[2-3]。雖然成本問題得到了解決，但酵母酶轉化法也暴露了很多新的問題。2000年后日本開發(fā)了雙菌發(fā)酵法，即利用大腸桿菌和產氨棒桿菌等基因工程菌發(fā)酵生產CD PC。此法發(fā)酵工藝相對復雜，在CMP大幅降價后漸漸被淘汰。

近幾年來，隨著生物發(fā)酵技術的發(fā)展，酵母發(fā)酵法有了越來越大的優(yōu)勢。此法采用篩選過的高活力酵母為菌種，以CMP為原料采用無菌發(fā)酵技術生產CDPC，有菌種來源穩(wěn)定、菌種活力高、用量少、中間體雜質少、后處理簡單等特點[4]。但微生物發(fā)酵周期比較長，單位時間設備的產出比較小，需要更大的初期投入才能保證產能。

表1 胞磷膽堿合成方法優(yōu)缺點比較

1.2 灌流培養(yǎng)生產胞磷膽堿

灌流培養(yǎng)生產CDPC是在酵母發(fā)酵法的基礎上，利用特殊的設備，一方面源源不斷加入培養(yǎng)基和底物，另一方面通過重力沉淀、循環(huán)系統(tǒng)和切向過濾源源不斷提取出產品，從而實現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)的過程。通過此過程，可以在目前企業(yè)生產設備的基礎上，經過少量的設備改造，極大提高CDPC的產能和產量，提高設備利用率和產品質量，降低產品的成本。

1.2.1 灌流系統(tǒng)的組成

灌流系統(tǒng)由以下幾個部分組成：補料系統(tǒng)、循環(huán)過濾系統(tǒng)、出料系統(tǒng)、自動控制系統(tǒng)、其他輔助系統(tǒng)（在線清洗系統(tǒng)（CIP系統(tǒng)）和在線滅菌系統(tǒng)（SIP 系統(tǒng)））。

補料系統(tǒng)：向反應釜內補給發(fā)酵所需培養(yǎng)基以及CMP底物，需要無菌控制操作，由補料管路、補料罐、動力系統(tǒng)以及輔助的CIP、SIP組成。

循環(huán)過濾系統(tǒng)：將罐內反應液從底部提升，通過動力泵（隔膜泵或者蠕動泵）經過切向過濾的過濾器后，再回流到罐內，通過重力沉降，切向過濾可以將料液源源不斷循環(huán)，進而將不含細胞的反應液導出反應體系，是灌流系統(tǒng)的關鍵部分。

出料系統(tǒng)：將透過切向過濾膜的無細胞反應液抽離反應體系，由過濾器、動力泵（隔膜泵或者蠕動泵）以及配套管路，容器組成。

控制系統(tǒng)：整個系統(tǒng)的大腦，由PLC控制2臺變頻動力泵、液位控制器、自動隔膜閥、濁度控制器組成，一方面控制補料和出料的有序性，一方面保證細胞出料的清澈，保證濾膜不會過分堵塞。

其他輔助系統(tǒng)：由于整個系統(tǒng)需要在無菌環(huán)境下進行，在中試、放大生產中要符合GMP等相關規(guī)范，因此還需要在線清洗系統(tǒng)、在線滅菌系統(tǒng)以及其他輔助系統(tǒng)。

圖2 灌流系統(tǒng)

1.2.2 過程和原理

初期細胞培養(yǎng)時，細胞處于恢復期，此時細胞濃度比較低，代謝水平較低，主要利用葡萄糖等易利用底物進行自身增殖，對于利用CMP產生CDPC的能力比較弱，一般恢復期持續(xù)的時間比較長，選用有利于細胞生產的營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基可以使細胞快速生長。

進入對數(shù)期，當細胞積累達到一定濃度后，源源不斷的加入CMP底物，在膽堿激酶和磷酸化酶為主的酶系的作用下，CMP和含有膽堿、磷酸的底物共同作用，發(fā)生生物酶反應，產生CDPC。

隨著CDPC的累計，當摩爾轉化率達到90%的時候，反應趨于平衡，此時繼續(xù)加入CMP會使得CMP和CDPC的濃度都增加，CDPC增加的速度較慢，摩爾轉化率反而降低。此時通過灌流系統(tǒng)，將反應液抽出，抽出后再補料加入培養(yǎng)基和CMP的混合底物，一方面保證細胞的正常生長，一方面可以繼續(xù)轉化生成CDPC。灌流抽出一定的CDPC溶液，并補加適當量的CMP，此時CDPC轉化率會從90%立刻跌到70%左右，但由于平衡被破壞，在酶的作用下，CMP繼續(xù)反應生成CDPC，直到再次達到平衡。

圖3 灌流系統(tǒng)

2 酵母發(fā)酵法和灌流培養(yǎng)法生產CDPC的實驗比較

2.1 菌種

經篩選過的啤酒酵母菌株LP30925（企業(yè)內部菌種編號）。

2.1.2 培養(yǎng)基

1）酵母發(fā)酵法所用培養(yǎng)基：

培養(yǎng)基1：酵母培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基2：在培養(yǎng)基1的基礎上進行調配，調配后酵母濃度為3%～7%，磷酸膽堿0.5%～2%，磷酸0.5%～2%，葡萄糖10%～20%，硫酸鎂0.1%～0.5%，培養(yǎng)過程需要1～2次補糖，每次3%～10%。

2）灌流培養(yǎng)法所用培養(yǎng)基：

培養(yǎng)基1：酵母培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基2：基本同酵母發(fā)酵法所用培養(yǎng)基2相同，葡萄糖濃度和補糖濃度同比降低25%～50%。

2.1.3 主要儀器和設備

DZ05A發(fā)酵罐、紫外分析儀、電泳儀（槽）、紫外分光光度計、高效液相色譜儀。

2.1.4 培養(yǎng)方法

1）酵母發(fā)酵法：將酵母菌株加入到預先滅菌的培養(yǎng)基1中，進行無菌培養(yǎng)，10～15 h進入對數(shù)生長期，15～25 h后酵母濃度達到3%～7%，此時加入CMP、磷酸膽堿、糖等輔料，調配成培養(yǎng)基2的濃度進行反應，反應30 h左右，摩爾轉化率可以達到90%以上（折算重量轉化率142%）；然后經過機械過濾、層析柱層析、減壓濃縮、甲乙醇結晶得到成品固體CDPC。

2）灌流培養(yǎng)法：30 h前培養(yǎng)方法同酵母發(fā)酵法，反應30 h左右，摩爾轉化率可以達到90%以上 （折算重量轉化率142%）；此刻酵母濃度為9.5%以上，開始灌流，每2 h從罐內抽出25%體積的反應液，并補入同體積含適當CMP濃度的培養(yǎng)基，抽取補料過程消耗時間約20 min，剩余100 min為反應時間，100 min后，轉化率可再次達到90%，再次循環(huán)灌流，期間酵母濃度穩(wěn)定在9.5%～11%之間，緩慢提升。灌流72～96 h后，細胞活力下降，滅菌放罐結束反應并進行清洗滅菌等操作。

經試驗，灌流培養(yǎng)在轉化率達到平衡后可以維持72～96 h，最終因為酵母濃度過高，衰亡酵母自溶產物過多導致灌流系統(tǒng)能力下降，此時考慮結束灌流培養(yǎng)，采用和舊法相同的滅活過濾方法獲得最終產品。

2.1.5 主要分析方法

1）酵母濃度檢測：離心管稱重，記為m1；稱取酵母發(fā)酵液樣品，計為m2，5000 r/min離心5 min后去上清，倒扣靜置1 min，擦拭離心管口的殘液后稱重，計為m3。酵母濃度根據(jù)以下公式計算：

酵母濃度C=(m3-m1)/(m2-m1)×100%。

此法檢測的酵母濃度為濕酵母濃度。

2）酵母摩爾轉化率快速檢測法：因為發(fā)酵液包含雜質很多，對色譜柱損傷比較大，加上HPLC檢測時間較長（一般30～40 min），在生產中一般使用酵母摩爾轉化率快速檢測法。

取酵母發(fā)酵液樣品離心后的上清液，取樣10 μL點入預先制備好的四硼酸鈉—瓊脂糖電泳凝膠中，在電泳槽內200～300 V電壓跑板3～6 min，在254 nm紫外燈下查看會出現(xiàn)清晰的兩條紫外吸收帶，其中遠端為CDPC，近端為CMP，割膠（含空白），把三段凝膠分別放入裝有5 mL pH 2.0的鹽酸溶液試管中，沸水浴3～5 min融膠，靜置放冷，在280 nm紫外分光光度計下以空白為對照測量光吸收率 （非OD值），CMP和CDPC光吸收值分別為Acmp和Acdpc，轉化率根據(jù)以下公式計算：

轉化率T=Acdpc/(Acmp+Acdpc)×100%。

此法速度比藥典HPLC法一般要快10～20 min，精度和藥典HPLC法最大相差3%，適用于生產中間體控制，本文發(fā)酵過程的轉化率數(shù)據(jù)是依據(jù)此法測定得出。

3）色度檢測法：色度是CDPC成品的瓶頸指標，其主要產生于酵母分解產生的黃色色素，在過程中以測定溶液的A430作為色度指標。取酵母發(fā)酵液樣品離心后的上清液，以純化水為對照測定A430，即為色度指標。

4）成品收率：成品收率 =CDPC固體成品重量/投入的CMP重量 ×100%，由于發(fā)酵后段收率基本恒定，也可以用發(fā)酵液色譜定量乘以一定的損耗系數(shù)進行計算。

3 結果與討論

酵母培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)至10～15 h，酵母進入對數(shù)生長期，酵母濃度快速增加；15～25 h后酵母濃度達到3%～7%，此時加入CMP、磷酸膽堿、糖等輔料，調配成培養(yǎng)基2的濃度進行反應，酵母濃度和CDPC摩爾轉化率快速增長；反應30 h左右，酵母濃度和摩爾轉化率趨于穩(wěn)定（圖4、5）。

酵母培養(yǎng)在30 h后做滅活、放罐處理，若繼續(xù)培養(yǎng)，酵母會進入衰亡期導致濃度下降，CDPC摩爾轉化率則受產物反饋抑制，停止增長。灌流培養(yǎng)由于源源不斷補充新鮮的培養(yǎng)基，能維持酵母濃度的緩慢增長，灌流培養(yǎng)每次分離提取掉1/4罐體積的CDPC溶液，并補充新的CMP底物，因為破壞了反應平衡，使得CDPC可以繼續(xù)得到轉化。由于稀釋作用，使得CDPC轉化率曲線呈現(xiàn)鋸齒狀。72～96 h后做滅活、放罐處理。

圖4 酵母濃度—時間的關系曲線

圖5 摩爾轉化率—時間的關系曲線

從表2看出，灌流培養(yǎng)可以拉長有效反應時間，使得灌流培養(yǎng)前期種子細胞復蘇時間和后處理時間比重大大降低，單位時間收獲到更多的產品，提高了設備的利用率，灌流培養(yǎng)的產能是非灌流法的3.96倍，大幅降低了生產成本。

色度是CDPC成品的瓶頸指標，在過程中以測定溶液的A430作為色度指標，CDPC溶液的色度越低，表明產品的質量越高。表3可以看出，酵母培養(yǎng)CDPC溶液色度質量為0.788，灌流培養(yǎng)CDPC溶液色度質量為0.176。灌流培養(yǎng)CDPC溶液色度（A430值）與非灌流法相比，降低了77.7%，產品質量顯著提高。原因是灌流培養(yǎng)弱化了高溫滅活操作，減少了細胞破損產生的雜質，使得溶液色度降低，另外純度的增加也有利于后處理收率的提高和成品質量的提高。

4 結論

將灌流系統(tǒng)應用在CDPC生產中，可以大幅提高產品質量，提高產能，降低產品成本，進而快速填補市場的缺口，增加企業(yè)市場競爭力和企業(yè)效益。

表2 酵母發(fā)酵法和酵母發(fā)酵法灌流培養(yǎng)產量和產能對比

表3 酵母發(fā)酵法和酵母發(fā)酵法灌流培養(yǎng)質量（色度）對比

[1]劉然江．胞磷膽堿：循證醫(yī)學證據(jù)最強的神經保護藥物[J]．中國藥房，2011，22(12)：1071-1071.

[2]候立向，趙 ．胞二磷膽堿的發(fā)酵合成及其純化[J]．生物化學與生物物理進展，1979(5)：40-48．

[3]徐仁華，徐敏，郁其平．胞二磷膽堿鈉的制備方法：中國，200610 096512.8[P]，2006-09-28．

[4]邱蔚然，周長林，王鵬飛，等．一種生物轉化胞磷膽堿的釀酒酵母菌種及應用：中國，201310358526.2[P]．2013-08-15．