史俊友 景年華 李彩霞（曲靖師范學(xué)院，云南 曲靖 655011）

大葉白麻（Poacynum hendersonii），為夾竹桃科白麻屬的一種多年生草本植物，與羅布紅麻和白麻并稱(chēng)為“羅布麻”［1，2］。其具有延緩衰老、降壓、降脂、抗感冒、鎮(zhèn)靜安神等作用［3－5］，常與羅布紅麻一起被用來(lái)制作降壓藥和保健食品。研究表明，大葉白麻葉中含有酚類(lèi)、鞣質(zhì)、多糖、黃酮、強(qiáng)心苷、內(nèi)酯、香豆素、甾體等物質(zhì)［6］，其中黃酮含量最高且被認(rèn)為是其主要藥效成分，約占大葉白麻葉總質(zhì)量的5%～6%［7］。目前已確定的黃酮類(lèi)成分包括異槲皮苷、槲皮素、紫云英苷、三葉豆苷、金絲桃苷、新異蕓香甙、異槲皮苷－6′－O－乙酰基、三葉豆苷－6′－O－乙?；?種物質(zhì)［8－10］。定量分析表明，異槲皮苷、槲皮素－3－O－槐糖苷和異槲皮苷－6′－O－丙二酸酯為含量最高的3種成分［11］，其中異槲皮苷，又稱(chēng)羅布麻甲素，具有良好的降壓效果，是羅布麻藥材中具有代表性的活性黃酮類(lèi)化合物［12］。因此，大葉白麻葉中總黃酮的高效提取對(duì)于開(kāi)發(fā)利用大葉白麻資源具有重要的意義。

目前大葉白麻中總黃酮的提取方法有熱水提取法、乙醇提取法、丙酮提取法［13］、堿性稀醇提取法、超聲提取法［14］等，但國(guó)內(nèi)外尚無(wú)利用超臨界CO2流體萃取大葉白麻中黃酮的相關(guān)報(bào)道。超臨界CO2萃取具有能耗小、效率高、無(wú)污染、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還可通過(guò)改變臨界溫度和壓力達(dá)到選擇性提取、分離、純化的目的［15－17］，目前在天然產(chǎn)物有效成分的提取中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。本試驗(yàn)擬以大葉白麻葉為原料，以乙醇作為夾帶劑，采用正交設(shè)計(jì)方法對(duì)大葉白麻中總黃酮的超臨界萃?。⊿CDE）工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨為大葉白麻總黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大葉白麻葉：采摘于青海省格爾木市；

二氧化碳：食品級(jí)，云南昆明特種氣體廠；

蘆丁對(duì)照品：純度98%，中國(guó)藥品生物檢定所；

無(wú)水乙醇：分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工公司；

硝酸鋁：分析純，上海艾比化學(xué)試劑有限公司；

亞硝酸鈉：分析純，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；

超臨界流體萃取儀：HA221－40－10＋2型，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；

紫外分光光度計(jì)：TU1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

電子天平：MSE323S型，德國(guó)賽多利斯公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DZF－6050型，北方利輝試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；

中草藥粉碎機(jī)：FW177型，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 將采摘的大葉白麻葉用清水洗凈后于陰涼處陰干，在烘箱中于70℃條件下烘烤4h，取出，放入中藥粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)20目篩備用。

1.2.2 大葉白麻總黃酮的提取 稱(chēng)取已粉碎的大葉白麻樣品150g裝入萃取裝置，將超臨界萃取儀調(diào)節(jié)至預(yù)定參數(shù)后進(jìn)行超臨界萃取，不斷加入選定的夾帶劑乙醇，并控制夾帶劑流速在6～10mL/min，后改變夾帶劑濃度、夾帶劑酸堿度、萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間、夾帶劑用量等參數(shù)，于各不同條件下提取大葉白麻總黃酮［18，19］。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）夾帶劑濃度的確定：因CO2為非極性物質(zhì)，單純的超臨界CO2流體很難對(duì)極性較大的黃酮類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行高效萃?。?0］。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，充分考慮試驗(yàn)安全性和經(jīng)濟(jì)成本因素，本試驗(yàn)選擇乙醇作為夾帶劑。在夾帶劑pH＝7的條件下，固定夾帶劑用量600mL，萃取時(shí)間120min，萃取溫度45℃，萃取壓力20MPa，CO2流量30L/h的條件下，分別選擇濃度為50%，60%，70%，80%，90%的乙醇做夾帶劑進(jìn)行萃取試驗(yàn)。

（2）夾帶劑酸堿度的確定：選定70%乙醇為夾帶劑，在萃取壓力20MPa，萃取溫度45℃，CO2流量30L/h，夾帶劑用量600mL，萃取時(shí)間120min的條件下，考察pH值［14］分別為6，7，8，9，10，11時(shí)對(duì)黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 在確定夾帶劑的濃度和酸堿度后，在預(yù)試驗(yàn)和文獻(xiàn)［17～19］的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)以?shī)A帶劑的用量、壓力、時(shí)間、溫度等作為影響因素，根據(jù)L9（34）的正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，并進(jìn)行了四因素三水平的正交試驗(yàn)，以確定最佳工藝，具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels list of orthogonal tests

1.2.5 總黃酮含量的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［21］和［22］，修改如下：準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)減壓干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.0mg，置于10mL容量瓶中，加入60%乙醇適量使之完全溶解，用水稀釋至刻度并搖勻，即得濃度為1.0mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，置于10mL容量瓶中，分別加30%乙醇至溶液總體積為5.0mL，后加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，再放置6min，加1mol/L氫氧化鈉溶液4mL，分別用水稀釋至刻度，搖勻，靜置15min后分別在510nm處測(cè)定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度。采用最小二乘法得線性回歸方程：A＝0.032 1c＋0.082 3（r2＝0.999 4）。準(zhǔn)確吸取大葉白麻黃酮粗提液1.0mL，加入60%乙醇溶液4mL，后采用與上文相同的顯色方法測(cè)定大葉白麻葉中總黃酮含量。本試驗(yàn)所涉及樣品均平行測(cè)試3次，后求平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 夾帶劑濃度對(duì)大葉白麻總黃酮提取率的影響

由圖1可知，夾帶劑乙醇的濃度對(duì)大葉白麻總黃酮提取率影響顯著，隨著乙醇濃度的提高，黃酮類(lèi)化合物提取率不斷增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%以后，隨著乙醇濃度增大總黃酮得率略有下降，故宜選擇70%乙醇作為夾帶劑。此結(jié)果與王寧［6］、張永秀［13］等采用溶劑提取法所得結(jié)果一致，其原因是大葉白麻中黃酮類(lèi)物質(zhì)多為黃酮苷［11］，極性較大，故中等極性的溶劑更為適合。當(dāng)乙醇濃度稍低時(shí)，溶劑極性過(guò)大，黃酮提取率較低，同時(shí)存在萃取釜內(nèi)樣品板結(jié)的情況；當(dāng)乙醇濃度較高時(shí)，夾帶劑極性較小，不適合大葉白麻總黃酮的提取。故采用濃度70%左右的乙醇提取大葉白麻總黃酮。

圖1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Figure 1 The influence of ethanol's different concentrations on the extraction rate of flavonoids

2.2 夾帶劑酸堿度對(duì)大葉白麻總黃酮提取率的影響

因黃酮中酚羥基顯酸性，故黃酮類(lèi)物質(zhì)可溶于堿性溶劑，但難溶于酸性溶劑，選擇合適的夾帶劑pH值對(duì)提高黃酮化合物的提取率具有促進(jìn)作用。由圖2可知，適當(dāng)提高pH值可提高總黃酮提取率，當(dāng)pH值為10時(shí)總黃酮的提取率最高，故后續(xù)試驗(yàn)中采用pH值為10的乙醇為夾帶劑提取大葉白麻中的總黃酮［19］。

圖2 夾帶劑酸堿度對(duì)總黃酮提取率的影響Figure 2 The influence of ethanol's pH value on the extraction rate of flavonoids

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，各因素中對(duì)大葉白麻總黃酮提取率影響最大的為溫度，其余因素的大小程度依次為：夾帶劑用量＞萃取時(shí)間＞萃取壓力。提取大葉白麻黃酮類(lèi)化合物最佳工藝條件為：A1B1C2D3。按照最佳工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得大葉白麻中總黃酮的平均提取率為5.28%，優(yōu)于正交設(shè)計(jì)中的任意一個(gè)組合。另外，該方法的提取率高于前人［6，13，14］所采用的各種溶劑提取法，詳見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析Table 2 Results of orthogonal tests and data analysis

表3 大葉白麻總黃酮不同提取方法比較Table 3 The comparation of different extraction methods for total flavonoids fromPoacynum hendersonii

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)對(duì)大葉白麻中總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了超臨界CO2流體法萃取大葉白麻總黃酮的最佳工藝條件：夾帶劑為70%乙醇，在pH值為10的情況下，提取所需溫度為45℃、壓力為20MPa、提取時(shí)間為2h。在此條件下，大葉白麻總黃酮平均提取率為5.28%。與常規(guī)溶劑回流提取法相比，其操作簡(jiǎn)單、提取率高、活性成分保存好、品質(zhì)高，是一種很好的大葉白麻總黃酮分離技術(shù)。夾帶劑的使用雖然提高了萃取率，但同時(shí)也導(dǎo)致了樣品的溶脹甚至板結(jié)的問(wèn)題，且在使用過(guò)程中夾帶劑含水量不宜過(guò)高，建議在50%以下。

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