刁 亞 沈和定 程知慶 姚理想（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

瘤背石磺（Onchidium struma）是一種具有重要經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值的貝類，它屬于軟體動物門、腹足綱、肺螺亞綱、縮眼目。常生活在咸淡水交匯處的高潮帶灘涂，俗稱海癩子、土雞、土海參等［1］。瘤背石磺的出肉率很高，肌肉中富含蛋白質(zhì)。管菊等［2］發(fā)現(xiàn)瘤背石磺肌肉中粗蛋白含量高達55%以上，是極好的蛋白質(zhì)來源。當(dāng)前國內(nèi)外對于瘤背石磺的研究主要集中在神經(jīng)、繁殖等領(lǐng)域［3］，對于其體內(nèi)活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多肽等研究仍較少。近些年的研究發(fā)現(xiàn)動物蛋白具有抗衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等生理功能［4－6］。Khodabandeh等［7］從石磺的卵細胞中分離得到的一種對乳腺癌細胞有一定抗癌活性的蛋白質(zhì)。目前動物蛋白提取的方法主要有酸法、堿法和酶法［3］，其中酶法提取因反應(yīng)條件溫和、無不良反應(yīng)且進程易控制，已成為當(dāng)今研究的熱點［8－10］。

為了提高蛋白的提取率，需要對其提取工藝條件進行優(yōu)化，而響應(yīng)面法或正交試驗是常用的試驗優(yōu)化設(shè)計方法［11］，如魯寧等［12］利用響應(yīng)面法對雞胸軟骨膠原蛋白水解工藝進行了優(yōu)化；曹文紅等［13］利用正交試驗優(yōu)化青鱗魚酶解工藝參數(shù)等。在工藝優(yōu)化過程中，正交試驗?zāi)軌蜉^全面考察多因素多水平，它的優(yōu)點在于方法簡便，試驗次數(shù)較少，實施較為簡單，但無法確定整個區(qū)域上因素的最優(yōu)條件與響應(yīng)值，與實際情況可能存在偏差［14］。而響應(yīng)面法的優(yōu)點在于建?？焖伲囼灳_度高，預(yù)測性更好。但是響應(yīng)面法也有一定的局限性，如果試驗點選取不當(dāng)，也無法找到最優(yōu)條件［15］。

為了避免工藝優(yōu)化試驗的盲目性和隨意性，本試驗擬采用響應(yīng) 面法［16，17］和 正交試 驗 法［18，19］對 瘤 背 石 磺 肌 肉 蛋 白 酶解提取工藝優(yōu)化進行比較研究，探討兩種方法對瘤背石磺肌肉蛋白提取工藝的差別，旨為節(jié)約蛋白資源以及瘤背石磺的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瘤背石磺：采于上海崇明堡鎮(zhèn)菜市場；

胰蛋白酶：4×103U/g，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

石油醚、無水乙醇、鹽酸等：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗儀器

全自動凱氏定氮儀：K12A型，上海晟聲分析儀器有限公司；

電子分析天平：AL104型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；

pH計：UB－7型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV－7502PC型，上海精密儀器有限公司；

低速臺式離心機：TDZ6B－WS型，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；

雙列六孔恒溫水浴鍋：HWS－26型，上?；厶﹥x器制造有限公司；

電熱恒溫干燥箱：DHG－9077A型，上海精宏試驗設(shè)備有限公司；

組織切碎機：QSJ－D162型，廣東小熊電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 預(yù)處理 將采集于崇明的瘤背石磺致死，解剖去除內(nèi)臟，用4℃蒸餾水洗凈后放入燒瓶中，加入適量石油醚去脂12h，過濾后加入適量無水乙醇處理6h去除石油醚，洗凈后放入烘箱烘焙12h得到瘤背石磺粉。

1.3.2 提取率測定 采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5—2003）測定樣品中的粗蛋白含量，考馬斯亮藍法［20］測定水溶性蛋白含量。瘤背石磺肌肉蛋白提取率按式（1）計算：

式中：

R——瘤背石磺肌肉蛋白的提取率，%；

m1——水解液中水溶性蛋白的含量，g；

m2——樣品粗蛋白的含量，g。

1.3.3 瘤背石磺肌肉蛋白的酶解工藝 稱取1.0g粉碎的瘤背石磺粉，按照酶解條件（溫度、pH、時間、液固比和加酶量）進行酶解試驗，得到酶解液。反應(yīng)結(jié)束后，在95℃高溫下滅活15min，待溶液冷卻后，放入高速冷凍離心機中離心（4 000r/min）10min，取上清液測試提取率。

1.3.4 單因素試驗

（1）酶解溫度：在酶解時間2h，pH 8.0，液固比80∶1（V∶m），加酶量10%的條件下，考察酶解溫度30，35，40，45，50，55，60℃對蛋白提取率的影響。

（2）pH：在酶解溫度35℃，酶解時間2h，液固比80∶1（V∶m），加酶量10%的條件下，考察pH 7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0對蛋白提取率的影響。

（3）酶解時間：在酶解溫度35℃，pH 8.0，液固比80∶1（V∶m），加酶量10%的條件下，考察酶解時間1，2，3，4，5，6，7h對蛋白提取率的影響。

（4）液固比：在酶解時間2h，pH 8.0，酶解時間2h，加酶量10%的條件下，考察液固比40∶1，50∶1，60∶1，70∶1，80∶1，90∶1，100∶1（V∶m）對蛋白提取率的影響。

（5）加酶量：在酶解時間2h，pH 8.0，酶解時間2h，液固比80∶1（V∶m）的條件下，考察加酶量4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%對蛋白提取率的影響。

1.3.5 正交試驗及響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對酶解效果影響顯著的因素，以蛋白提取率為評價指標(biāo)，設(shè)計正交試驗或響應(yīng)面試驗，以優(yōu)化其酶解工藝。

1.4 數(shù)據(jù)分析軟件

采用正交設(shè)計助手II專業(yè)版及Design－expert 8.0.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解前瘤背石磺肌肉粗蛋白測定的結(jié)果

采用凱氏定氮法測定瘤背石磺肌肉粗蛋白含量，經(jīng)過3次重復(fù)試驗，得出蛋白質(zhì)含量為59.87%，證明瘤背石磺肌肉的蛋白質(zhì)含量相當(dāng)高，具有很大的研究價值。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對蛋白提取率的影響 由圖1可知，隨著酶解溫度的提高，提取率表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，當(dāng)溫度在30～45℃時，溫度不斷升高，分子的動能也在不斷增加，底物與酶之間的接觸幾率也在增加［21］，因此蛋白提取率逐漸上升；溫度達到45℃時，提取率最大，為7.02%；但超過45℃后，酶的活力開始下降，甚至失活，因此控制最適酶解溫度為45℃左右。

圖1 酶解溫度對蛋白提取率的影響Figure 1 Influence of enzymolysis temperature on protein extraction rate

2.2.2 酶解時間對蛋白提取率的影響 由圖2可知，當(dāng)酶解時間為2h時，提取率最大，超過2h后，提取率開始下降。這可能是因為酶在反應(yīng)過程中逐漸失活，而且還會分解溶液中溶出的蛋白質(zhì)［22］，導(dǎo)致蛋白提取率逐漸降低，因此控制酶解時間在2h左右。

圖2 酶解時間對蛋白提取率的影響Figure 2 Influence of enzymolysis time on protein extraction rate

2.2.3 pH對蛋白提取率的影響 pH會改變酶中心的構(gòu)象，使酶活性中心的催化基團和結(jié)合集團受到影響［23］。由圖3可知，pH為9.0時，提取率為最大值，達到7.12%。但pH繼續(xù)上升，提取率反而下降，這可能是因為pH過高導(dǎo)致酶活性降低甚至失活［24］。因此最適pH為9.0。

2.2.4 液固比對蛋白提取率的影響 由圖4可知，液固比在90∶1（V∶m）以下時，提取率持續(xù)上升，當(dāng)液固比為90∶1（V∶m）時，提取率達到最大值，繼續(xù)提升液固比，提取率開始下降，因此選取90∶1（V∶m）左右作為試驗條件。

圖3 pH對蛋白提取率的影響Figure 3 Influence of pH value on protein extraction rate

圖4 液固比對蛋白提取率的影響Figure 4 Influence of liquid－solid rate on protein extraction rate

2.2.5 加酶量對蛋白提取率的影響 由圖5可知，在加酶量為4%～10%時，對蛋白提取率的影響并不顯著，加酶量在9%時，提取率最大，考慮到生產(chǎn)成本問題，選取9%作為試驗條件。

圖5 加酶量對蛋白提取率的影響Figure 5 Influence of volume of enzyme on protein extraction rate

綜上所述，酶解溫度、酶解時間、pH和液固比對酶解效果影響較顯著，而加酶量對酶解效果的影響不太顯著。因此固定加酶量為9%，以酶解溫度、酶解時間、pH和液固比進行后續(xù)的正交試驗及響應(yīng)面試驗。

2.3 正交試驗結(jié)果

按L16（45）正交設(shè)計進行胰蛋白酶水解瘤背石磺肌肉蛋白的正交試驗，各因素水平設(shè)計見表1。

由表2可知，各因素影響順序為：酶解溫度＞酶解時間＞液固比＞pH；最優(yōu)工藝為A3B2C3D3。

由表3可知，4種因素對于蛋白提取率的影響都極顯著。

表1 正交試驗因素及水平表Table 1 Levels of experiment factor of orthogonal design

表2 L16（45）正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experiment and results of L16（45）orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

采用中心組合試驗對胰蛋白酶酶解工藝條件進行分析和優(yōu)化，因素編碼及水平見表4。

表4 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 4 The response surface of level and factor

通過軟件對表5數(shù)據(jù)進行分析，得到酶解溫度、pH、酶解時間和液固比與蛋白提取率之間的模擬方程見式（2）：

由表6可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），確 定 系 數(shù)R2為 0.989 9，調(diào) 整 確 定 系 數(shù)為0.979 8，說明此模型與實際情況相符，誤差較小。

方差分析結(jié)果還表明各因素之間存在一定的交互作用，其中 A、B、C、D、A2、B2、C2、D2影響均極顯著（P＜0.01），BD影響顯著（P＜0.05），而 AB、AC、AD、BC、CD均不顯著。

表5 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 5 The results of response surface

表6 響應(yīng)面試驗方差分析Table 6 The variance analysis of response surface

2.5 回歸模型優(yōu)化

由于交互項中AB、AC、AD、BC和CD對蛋白提取率的影響并不顯著，因此采用手動優(yōu)化的方法對回歸模型再一次進行優(yōu)化，結(jié)果見表7。

表7 去掉交互項AB、AC、AD、BC和CD后的優(yōu)化結(jié)果Table 7 The optimization results of excluding AB，AC，AD，BC and CD

經(jīng)過手動優(yōu)化后的模擬方程見式（3）：

由表7可知，優(yōu)化后的模型極顯著（P＜0.01），同時失擬項不顯著（P＞0.05），R2為0.982 8為0.974 6，說明此模型是可靠的。從F值的大小可以得到各單因素的影響順序為A＞B＞C＞D，即酶解溫度＞酶解時間＞pH＞液固比。

2.6 響應(yīng)面曲面分析及優(yōu)化

圖6給出了交互項BD的等高線圖和響應(yīng)面圖，隨著酶解時間和液固比的增加，蛋白提取率都是先增加后減小；說明只有取某個適中值時，才可以使蛋白提取率達到最大。由圖6還可以看出，酶解時間與液固比的交互作用對蛋白提取率的影響較顯著，這與表7中的結(jié)果一致。

圖6 Y＝f（B，D）的等高線圖和響應(yīng)面圖Figure 6 The contour map and response surface graph of BD

2.7 響應(yīng)面法與正交試驗法比較

對上述兩種方法得到的最優(yōu)工藝結(jié)果進行驗證實驗，結(jié)果表明，正交試驗法優(yōu)化得到的最佳工藝條件為：酶解溫度45℃，酶解時間2h，pH 9.0，液固比90∶1（V∶m）；而響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳工藝條件為：酶解溫度44.31℃，酶解時間2.27h，pH 9.00，液固比92.21∶1（V∶m），為了便于生產(chǎn)，經(jīng)調(diào)整后得到的工藝條件為酶解溫度44℃，酶解時間2.3h，pH 9.0，液固比93∶1（V∶m），兩種方法通過3次驗證實驗得到的蛋白提取率平均值分別為8.51%和8.74%。

3 結(jié)論

（1）通過比較響應(yīng)面法和正交試驗對酶解瘤背石磺肌肉蛋白條件的優(yōu)化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種試驗設(shè)計方法在分析各因素對水解度的影響上得出的結(jié)果基本一致，但響應(yīng)面法對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析優(yōu)于正交試驗法；兩種方法得到的最優(yōu)工藝驗證結(jié)果表明，響應(yīng)面法得到的最優(yōu)工藝獲得的平均蛋白提取率比正交試驗法高出2.70%。

（2）酶解瘤背石磺肌肉蛋白最優(yōu)工藝的確定以響應(yīng)面法為準，最終確定為酶解溫度44℃，酶解時間2.3h，pH 9.0，液固比93∶1（V∶m）。在此條件下，提取率達到8.74%。有理論研究［25］表明，動物蛋白中含有大量生物活性肽，而通過酶解反應(yīng)可以釋放出這些具有特殊生物學(xué)功能的活性肽，因此本研究可為后續(xù)瘤背石磺肌肉蛋白的利用和開發(fā)，以及瘤背石磺肌肉蛋白中的活性肽分離純化和活性研究提供理論依據(jù)。

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