曲玲玲 郭長慧 劉麗潔 張 娜（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

大豆蛋白經(jīng)蛋白酶作用后，再經(jīng)分離、精制等過程得到蛋白質水解產(chǎn)物，該水解產(chǎn)物由多種肽混合組成，其中還含有少量游離氨基酸、糖類和無機鹽等成分［1－3］。水解產(chǎn)物具有降血壓、抗氧化、減肥及促進礦物質吸收等多種生理功能，使其在食品工業(yè)上具有廣闊的開發(fā)應用前景［4－6］。

中國對大豆多肽的研究起步較晚，基礎和應用研究都很薄弱，尚處于初級開發(fā)應用階段，具有極大市場潛力。本研究采用的豆粕是豆油加工的副產(chǎn)品，成本低廉，來源廣泛。目前豆粕主要用作飼料，在食品方面應用極少，而且只限于釀造食品。脫脂豆粕中蛋白含量較高（45%～50%），氨基酸平衡，且較大豆分離蛋白和大豆?jié)饪s蛋白價格便宜，因此利用豆粕加工大豆多肽有很高的開發(fā)和利用價值［7，8］。

灰色關聯(lián)分析是灰色系統(tǒng)理論的基礎，實質上是關聯(lián)系數(shù)的分析，目的是尋求系統(tǒng)中各因素間的主要關系、找出影響目標值的重要因素，從而掌握事物的主要特征，促進和引導系統(tǒng)迅速而有效地發(fā)展。自1982年鄧聚龍教授［9］創(chuàng)立灰色系統(tǒng)理論以來，灰色關聯(lián)分析已成功應用于聚類、預測、決策、評估、模式識別、系統(tǒng)指標權重確定、建模精度檢驗及診斷等方面［10－13］。在對復雜系統(tǒng)進行分析時，以往多采用統(tǒng)計分析或其它分析法，灰色關聯(lián)分析法與之相比的優(yōu)勢在于：灰色關聯(lián)分析是按發(fā)展趨勢做分析，因此對樣本量的多少沒有過多的要求，也不需要典型的分布規(guī)律，而且計算量比較小，其結果與定性分析結果比較吻合。目前灰色關聯(lián)分析在食品方面的應用較少，其不僅是優(yōu)勢分析的基礎，還是進行科學決策的依據(jù)［14］。

為了提高大豆蛋白資源的利用率，降低大豆肽的生產(chǎn)成本，提高大豆肽的水解度，獲得具有高溶解度、低黏度等優(yōu)良加工特性的大豆肽。黃雅燕等［15］曾運用正交試驗對堿性蛋白酶水解豆粕制備大豆多肽的工藝條件進行優(yōu)化。本研究擬利用Alcalase堿性蛋白酶水解大豆脫脂豆粕，測定低溫豆粕中的蛋白含量、水解度，選用灰色關聯(lián)分析法對大豆蛋白酶解過程進行工藝優(yōu)化，建立不同條件下水解制備大豆蛋白水解模型，以利用該模型在一定范圍內預測大豆蛋白酶解程度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆脫脂豆粕粉：哈高科大豆食品有限責任公司；

Alcalase（2.4LFG）酶：酶活4.4萬 U/g，丹麥諾維信公司；

氫氧化鈉、甲醛：分析純，天津市大陸化學試劑廠；

鹽酸：分析純，西隴化工有限公司；

福林酚：分析純，天津光復科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平：YB－10002型，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；

電子分析天平：e－10d型，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；

真空干燥箱：DZF－6020型，上海一恒科學儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK－98－IIA型，天津泰斯特儀器有限公司；

分光光度計：722型，上海佑科儀器儀表有限公司；

臺式離心機：TDL80－2B型，上海安亭科學儀器廠；

pH計：PHS－3C型，上海精密儀器有限公司；

萬用電爐：DL－1型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；

架盤天平：HC－TP11－5型，上海精科天平。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白的酶解 準確稱取 Alcalase（2.4LFG）酶0.340 9g，用蒸餾水定容至100mL，準確吸取1mL，用蒸餾水定容至100mL。稱取脫脂豆粕10g，加水配成5%（m/V）的懸濁液，攪拌分散，用1.0mol/L HCl調pH 值為4.5，45℃洗糖60min，再抽濾，取固體物質再次攪拌溶解配成5%（m/V）的懸濁液，用1.0mol/L HCl調 pH 值為4.5，45℃洗糖30min，再抽濾，取固體物質再次攪拌溶解配成5%（m/V）的懸濁液，反應過程中用5%NaOH溶液維持系統(tǒng)pH值恒定（±0.10），加酶1mL，升溫至55℃保溫酶解3h，抽濾取上清液，再升溫至100℃保溫滅酶10min，冷卻后，抽濾，再將上清液濃縮干燥，得到大豆蛋白水解物。

1.3.2 酶活的測定 采用福林酚法［16］。

1.3.3 大豆蛋白酶解的單因素試驗

（1）pH值對脫脂豆粕酶解的影響：固定時間為3h，溫度為55℃，加酶量為1 500U/g，底物濃度為3%（m/V），分別在pH 值為8.0，8.5，9.0，9.5，10.0的條件下，測定水解后上清液中的蛋白質含量和水解度。

（2）溫度對脫脂豆粕酶解的影響：固定時間為3h，pH值為9.0，加酶量為1 500U/g，底物濃度為3%（m/V），分別在溫度為45，50，55，60，65℃的條件下，測定水解后上清液中的蛋白質含量和水解度。

（3）時間對脫脂豆粕酶解的影響：固定溫度為55℃，pH值為9.0，加酶量為1 500U/g，底物濃度為3%（m/V），分別在時間為1，2，3，4，5h的條件下，測定水解后上清液中的蛋白質含量和水解度。

（4）加酶量對脫脂豆粕酶解的影響：固定溫度為55℃，pH值為9.0，時間為3h，底物濃度為3%（m/V），分別在加酶量為500，1 000，1 500，2 000，2 500U/g的條件下，測定水解后上清液中的蛋白質含量和水解度。

（5）底物濃度對脫脂豆粕酶解的影響：固定溫度為55℃，pH值為9.0，時間為3h，加酶量為1 500U/g，分別在底物濃度（m/V）為3%，4%，5%，6%，7%的條件下，測定水解后上清液中的蛋白質含量和水解度。

1.3.4 制備工藝的優(yōu)化 在單因素試驗結果的基礎上，選取溫度、加酶量、pH值、時間、底物濃度5個因素，利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件中“灰色系統(tǒng)方法關聯(lián)度分析”程序進行試驗方案設計，并對所得數(shù)據(jù)進行分析處理。

（1）灰色關聯(lián)分析原始數(shù)據(jù)變換：由于系統(tǒng)中各因素的量綱可能不同，數(shù)值的數(shù)量級也可能相差懸殊，很難直接進行比較。因此，本試驗采取均值化變換，先分別求出各個序列的平均值，再用平均值去除對應序列中的各個原始數(shù)據(jù)，所得到的新數(shù)據(jù)列，即為均值化序列。其特點是量綱為一，其值大于0，并且大部分近于1，數(shù)列曲線互相相交。經(jīng)過數(shù)據(jù)變換的母數(shù)列記為｛Y（t）｝，子數(shù)列記為｛Xi（t）｝［17］。

（2）關聯(lián)系數(shù)分析：關聯(lián)系數(shù)反映兩個被比較序列在某一時刻的緊密程度，關聯(lián)系數(shù)的范圍為0＜L≤1。經(jīng)數(shù)據(jù)變換的母數(shù)列記為｛Y（t）｝，子數(shù)列記為｛Xi（t）｝，則在時刻t＝k時母序列｛Y（k）｝與子序列｛Xi（k）｝的關聯(lián)系數(shù)L0i（k），按式（1）計算：

式中：

L0i（k）——關聯(lián)系數(shù)；

Δ0i（k）——k時刻兩比較序列的絕對差，即 Δ0i（k）＝｜Y（k）－Xi（t）｜；

Δmin——所有比較序列各個時刻絕對差中的最小值；

Δmax——所有比較序列各個時刻絕對差中的最大值；

ρ——分辨系數(shù)，取ρ＝0.5。

1.3.5 多元回歸分析 采用SPSS 19.0軟件中“回歸分析”程序分析底物濃度、加酶量、溫度、pH值、時間的回歸方程。

1.3.6 蛋白質含量的測定 采用凱氏定氮法［18］。

1.3.7 水解度的測定 采用甲醛滴定法［19－21］。

2 結果與分析

2.1 大豆蛋白酶解單因素試驗結果

2.1.1 pH值對低溫豆粕酶解的影響 由圖1可知，隨著pH值的增大，大豆蛋白水解度呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的變化趨勢。pH值為9.0時，大豆蛋白水解度達到13.31%。pH值為8.0～9.0時處于酶的最適pH，酶活力較大，隨pH值增加水解度增加；超過9.0后，酶雖未變性，但pH會影響底物的游離狀態(tài)，也會影響酶分子活性部位上有關基團的解離，進而影響酶與底物的結合與催化，使水解度變化趨于平緩［22］。權衡水解度、環(huán)境條件和試劑用量對產(chǎn)率的影響，選擇9.0作為最佳酶解環(huán)境的pH值。

圖1 pH值對水解度的影響Figure 1 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.2 溫度對低溫豆粕酶解的影響 由圖2可知，溫度由45℃增大到55℃時，大豆蛋白水解度出現(xiàn)增長趨勢；溫度為55℃時，大豆蛋白水解度達到12.68%；超過55℃之后，大豆蛋白水解度呈現(xiàn)降低的趨勢。這是由于在低溫階段酶活力較小，酶水解速度較低，在適宜溫度下，有利于蛋白結構的舒展，肽鍵更易與酶結合，酶水解速度加快，隨著溫度繼續(xù)升高，酶蛋白變性失活，導致水解度下降［23］。權衡水解度、環(huán)境條件以及試劑用量對產(chǎn)率的影響，選擇55℃作為最佳酶解環(huán)境的溫度。

圖2 溫度對水解度的影響Figure 2 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

2.1.3 時間對低溫豆粕酶解的影響 由圖3可知，隨著時間的延長，大豆蛋白水解度呈現(xiàn)先增長后趨于平穩(wěn)的變化趨勢。時間為3h時，大豆蛋白水解度達到13.24%。原因主要是由于Alcalase蛋白酶酶解需要一定的反應時間，隨著酶解反應的進行，酶與底物作用，水解程度不斷加深，水解度也隨之提高；在到達3h時，底物濃度減少，反應位點逐漸被酶分子飽和，可與酶作用的肽鍵數(shù)量減少，并且產(chǎn)物濃度增加，其競爭性抑制增強，酶的活性逐漸降低，因此出現(xiàn)先增長后趨向平穩(wěn)的變化過程［24］。權衡水解度、環(huán)境條件以及試劑用量對產(chǎn)率的影響，選擇3h作為最佳酶解環(huán)境的時間。

圖3 時間對水解度的影響Figure 3 Effect of time on the degree of hydrolysis

2.1.4 加酶量對低溫豆粕酶解的影響 由圖4可知，加酶量由500U/g增大到2 000U/g時，大豆蛋白水解度逐漸增長；加酶量為2 000U/g時，大豆蛋白水解度達到14.61%，之后，大豆蛋白水解度呈略微降低的變化趨勢。這是由于Alcalase蛋白酶酶解初期，酶濃度較低，底物過量，酶與底物完全結合，水解程度逐漸增大，水解度隨之呈現(xiàn)上升趨勢，在加酶量達到2 000U/g時酶在底物表面的作用已達到飽和，酶分子與底物不能充分接觸，而底物上可供酶切割的位點有限，多出的酶不能在底物上起作用［25］，因此水解度趨于平衡，有略微降低的趨勢［25］。因此，權衡產(chǎn)率、成本等相關因素，選擇2 000U/g作為最佳酶解環(huán)境的加酶量。

圖4 加酶量對水解度的影響Figure 4 Effect of the enzyme added of the degree of hydrolysis

圖5 底物濃度對水解度的影響Figure 5 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis

2.1.5 底物濃度對低溫豆粕酶解的影響 由圖5可知，隨著底物濃度的增大，大豆蛋白水解度呈現(xiàn)先增長后逐漸趨于平穩(wěn)的變化趨勢。底物濃度為5%（m/V）時，大豆蛋白水解度達到10.66%。這是因為在一定的加酶量條件下，底物濃度的增加會導致酶解的效率增加，使得所有的酶都可以在同一時間作用于底物，導致水解度不斷上升，當加酶量和底物相互平衡時達到酶解的最大效率，再增加底物濃度，酶解效率幾乎不變，導致水解度基本保持不變的狀態(tài)［26］。權衡水解度、環(huán)境條件以及試劑用量對產(chǎn)率的影響，選擇5%（m/V）作為最佳酶解環(huán)境的底物濃度。

2.2 灰色關聯(lián)分析

2.2.1 原始數(shù)據(jù)變換 利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件中“灰色系統(tǒng)方法關聯(lián)度分析”程序，得到原始數(shù)據(jù)均值化結果見表1。

2.2.2 關聯(lián)系數(shù)分析 由原始數(shù)據(jù)均值化結果得到所有比較序列各個時刻絕對差中最小差值Δmin和最大差值Δmax分別為0和0.481 65，利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件中“灰色系統(tǒng)方法關聯(lián)度分析”程序計算反應體系中各因素的關聯(lián)系數(shù)。根據(jù)不同因素的關聯(lián)系數(shù)（表2），排列出因素的顯著性為：pH值＞溫度＞底物濃度＞加酶量＞時間，因此大豆多肽的制作工藝參數(shù)中，pH值影響最顯著，時間的影響最不顯著。

2.3 多元回歸分析

采用SPSS 19.0軟件進行回歸分析，以水解度為因變量，pH值、溫度、底物濃度、加酶量、時間為自變量建立多元線性回歸方程［27］。運用SPSS 19.0軟件中“分析—回歸—線性”程序，得到回歸方程為：

根據(jù)回歸方程（2），可以預測反應體系pH值為8～10、溫度為45～65℃、時間為1～5h、底物濃度為3%～7%（m/V）以及加酶量為500～2 500U/g內的Alcalase堿性蛋白酶酶解大豆低溫豆粕的水解度。

表1 原始數(shù)據(jù)均值化結果Table 1 The average of the results of the original data

表2 反應體系中各因素關聯(lián)系數(shù)Table 2 Correlation coefficient of various factors in the reaction system

2.4 驗證實驗

為了驗證多元回歸分析線性回歸方程的可靠性，隨機假設3組Alcalase堿性蛋白酶酶解大豆低溫豆粕的反應條件，將方程預測的水解度和實測的水解度進行比較，結果見表3。由表3可知，預測的水解度和實測的水解度數(shù)值基本接近，表明預測值與真實值之間有很好的擬合性，因此灰色關聯(lián)分析方法得到的優(yōu)化工藝參數(shù)準確可靠，具有實用性。

表3 隨機降解條件驗證實驗Table 3 Random degrading conditions of validation experiments

3 結論

本試驗對Alcalase堿性蛋白酶酶解大豆蛋白過程進行優(yōu)化，以水解度為指標，確定大豆多肽酶解的最佳工藝參數(shù)為：反應體系pH值9.0，反應溫度55℃，反應時間3h，大豆脫脂豆粕添加量5%（m/V），Alcalase堿性蛋白酶的添加量2 000U/g，該條件下水解度為13.53%。本試驗使得大豆蛋白水解度得到了較大提高，下一步將對大豆蛋白水解產(chǎn)物的生理功能與水解度之間的關系進行更深入的研究。

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