王海燕 戴 軍 陳尚衛(wèi)（.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 40；.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 40）

靈芝（G.lucidum）屬擔(dān)子菌綱、多孔菌目、靈芝科、靈芝屬［1］，按其生長過程可分為菌絲體、子實體和孢子粉3個階段。中國靈芝屬真菌有75種，常見的有赤芝、紫芝、黑芝、松杉靈芝等。近年來，研究發(fā)現(xiàn)靈芝具有降血糖［2，3］、降血脂［4］、免疫調(diào)節(jié)［5］、抗腫瘤［6］、抗氧 化［7］等保健功 能，其主 要功效成分為多糖和三萜［8］。

作為靈芝的主要活性物質(zhì)之一，靈芝多糖類產(chǎn)品受到人們青睞。野生靈芝極為有限，傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基培植法受到生產(chǎn)周期長、生產(chǎn)效率低等制約，無法實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；液體深層發(fā)酵靈芝菌絲體多糖具有含量高、培養(yǎng)周期短、可大規(guī)模生產(chǎn)和易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點［9］，因此其成為研究熱點。

目前，關(guān)于靈芝菌絲體多糖的研究主要包括發(fā)酵優(yōu)化、結(jié)構(gòu)分析和活性檢測等方面［10－12］。本試驗為考察前期優(yōu)化的赤芝菌種在最佳發(fā)酵條件下得到的赤芝菌絲體粗多糖的組成特性，對該粗多糖分離純化后分別利用高效體積排阻色譜（HPSEC）、PMP柱前衍生化反相高效液相色譜（RP—HPLC）和多角度光散射（SEC—MALLS）等技術(shù)分別研究了各級分多糖的單糖組成、分子量分布以及鏈構(gòu)象特性，為進(jìn)一步對該赤芝多糖進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究和產(chǎn)品研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

赤芝菌絲體多糖樣品：本實驗室自制；

陰離子交換凝膠：DEAE－Sepharose CL－6B型，美國 GE Healthcare公司；

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：Dextran系列，美國Sigma公司；

甘露糖、鼠李糖等12種單糖標(biāo)準(zhǔn)品：＞97%，美國Sigma－Aldrich公司；

乙腈：色譜純，美國Tedia公司；

1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）：99%，美國Acros Organics公司；

三氟乙酸：化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸、苯酚、硫酸、三氯甲烷、無水乙醇、硝酸鈉、甲醇和氫氧化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Waters 1525型，美國Waters公司；

液相色譜系統(tǒng)：Aligent 1200型，安捷倫科技有限公司；

多角度激光光散射儀：DAWN8型，美國Wyatt公司；

可見光分光光度計：722N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

自動收集器及玻璃層析柱（3.2cm×25cm）：BSZ－100型，上海滬西分析儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE52－2型，上海亞榮生化儀器公司；

恒溫水浴鍋：HH－2型，江蘇省金壇市新航儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 靈芝菌絲體粗多糖的分離純化 脫蛋白、脫色后，將靈芝菌絲體多糖配制為濃度50mg/mL的水溶液。樣品上DEAE－Sepharose Fast Flow柱（3.2cm×25cm），用自動收集器前后分2次各收集洗脫液100管，第1次以pH 7.8的0.02mol/L Tris—HCl溶液為洗脫液，第2次以0.01～1.00mol/L NaCl溶液和0.02mol/L Tris—HCl溶液梯度洗脫，流速為8mL/min，每分鐘收集1管，每5管（每管取0.2mL，共1.0mL）用苯酚硫酸法［13］于490nm處測多糖的吸光值。收集主要峰組分，用截留分子量為3.5×103Da的透析袋透析48h除鹽后冷凍干燥得GLMP1、GLMP2和GLMP3。

1.2.2 級分多糖的高效體積排阻色譜法（HPSEC）分析 色譜條件參考文獻(xiàn)［14］，GLMP1、GLMP2和GLMP3分別配成濃度約為10mg/mL的水溶液，過0.45μm微孔濾膜后進(jìn)樣分析。

1.2.3 級分多糖的單糖組成分析

（1）樣品的完全酸水解：將多糖級分別溶于水配成濃度約為5mg/mL的溶液，吸取500μL溶液于具塞試管中，加入2mol/L TFA溶液500μL，充分混勻后充入N2封管，置于110℃烘箱中水解120min，取出冷卻至室溫，加入同體積的甲醇，氮氣吹干，重復(fù)3次后以1mL超純水溶解。

（2）混合單糖標(biāo)樣PMP衍生化：取100μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液（各單糖質(zhì)量濃度均為3mg/mL左右）與等體積0.6mol/L NaOH溶液混合均勻，取50μL上述混合液于5mL具塞試管中，加入0.5mol/L的PMP甲醇溶液50μL，旋渦混勻；70℃下反應(yīng)100min中，取出冷卻至室溫，加0.3mol/L的HCl溶液60μL中和pH，加水定容至1mL，再加入的1mL氯仿，振蕩使兩相充分接觸，靜置后棄去有機(jī)相，重復(fù)3次以除去多余的PMP試劑，將衍生化后的溶液過0.45μm微孔濾膜，進(jìn)樣分析。級分多糖樣品水解產(chǎn)物的PMP衍生化方法與混標(biāo)衍生化方法相同。

（3）RP—HPLC色譜條件：檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）；色 譜 柱：ZORBAX Eclipse XDB－C18（250mm×4.6mm i.d.，5μm）；流動相：0.1mol/L pH 6.7磷酸鹽緩沖液—乙腈（V/V＝83/17）；檢測波長：245nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min；進(jìn)樣體積：20μL

1.2.4 SEC—MALLS分析

（1）SEC—MALLS—RI體系：采用尺寸排除色譜和多角度光散射儀聯(lián)用裝置（SEC—MALLS）測試試樣的重均分子量（Mw）、多分散系數(shù)（Mw/Mn）及均方根旋轉(zhuǎn)半徑（RMS）。多角度激光光散射儀（MALLS）波長為633nm，用茁霉多糖（Mw＝1.18×104，Mw/Mn＝1.10）做為標(biāo)樣進(jìn)行歸一化。尺寸排除色譜裝置分別使用水體系的Shodex OHpak SB－805HQ和Shodex OHpak SB－804HQ 兩根色譜柱串 聯(lián) 和 示 差 折 光 檢 測 器 （RI－150，Thermo Finnigan，USA）。

（2）測試條件：流動相：0.2mol/L的 NaCl水溶液；流速：0.5mL/min；測試溫度：25℃；進(jìn)樣量：200μL。

（3）樣液制備：多糖級分分別溶于0.2mol/L的NaCl水溶液中，樣品濃度為1mg/mL。進(jìn)樣前樣品及流動相經(jīng)過0.2μm濾膜過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝菌絲體多糖的分離純化

通過DEAE－Sepharose Fast Flow柱的洗脫液以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線（圖1），按照出峰順序先后收集得到3個多糖級分分別命名為GLMP1、GLMP2和GLMP3，級分組分透析除鹽后凍干供后續(xù)分析。

圖1 靈芝菌絲體多糖通過DEAE－Sepharose Fast Flow柱洗脫曲線Figure 1 Elution curve of Ganoderma lucidummycelium polysaccharide on DEAE－Sepharose

2.2 級分多糖的高效體積排阻色譜法（HPSEC）分析

純度的概念是隨著分離分析手段的進(jìn)展而不斷發(fā)展的，多糖是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子，它的純度只代表多糖在某一鏈長的平均分布，因此通常意義上的多糖純度是指多糖在一定分子量范圍的均一分布［15］。高效體積排阻色譜（HPSEC）具有快速、高分辨率和重現(xiàn)性好的優(yōu)點，是目前最常見的鑒定多糖純度的方法。由圖2可知，除少量雜峰外3個級分均為單一對稱的峰型，可以視為均一的多糖。

圖2 GLMP1、GLMP2和GLMP3的HPSEC圖譜Figure 2 HPSEC elution profile of GLMP1，GLMP2and GLMP3

根據(jù)HPSEC圖中峰面積的百分比可知，3個級分多糖的純度分別為93.58%，97.64%，99.19%，少量雜峰為分子量0.5×103Da左右的多糖小分子。同時，以不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣，根據(jù)標(biāo)樣的保留時間和對應(yīng)分子量做出分子量校正曲線，再由軟件計算出級分多糖樣品的相對重均分子量（Mw）見表1。

表1 3個級分多糖的相對重均分子量及純度結(jié)果Table 1 The relative Mwand purity results of three polysaccharide fractions

2.3 單糖組成分析結(jié)果

12種單糖標(biāo)樣的PMP衍生化RP—HPLC色譜圖見圖3，在該色譜條件下12個單糖峰的分離效果較好。

GLMP1、GLMP2和GLMP3的單糖組成見圖4～6，與圖3中標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間對照可知，GLMP1、GLMP2和GLMP3均含有甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalUA）、葡萄糖（Glu）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）和巖藻糖（Fuc）。Ferreira等［16］研究發(fā)現(xiàn)液體深層發(fā)酵靈芝多糖的單糖組成中Ara來自于發(fā)酵液多糖而非菌絲體多糖。

圖3 12種單糖PMP衍生物的RP—HPLC圖譜Figure 3 Chromatograms of PMP derivatives of twelve kinds of monosaccharides by RP—HPLC

圖4 GLMP1PMP柱前衍生化的RP—HPLC圖譜Figure 4 RP—HPLC chromatograms of GLMP1by PMP derivatives

圖5 GLMP2PMP柱前衍生化的RP—HPLC圖譜Figure 5 RP—HPLC chromatograms of GLMP2by PMP derivatives

由表2可知，3個多糖級分均含有 Man、Rha、GalUA、Glu、Gal、Xyl、Ara和Fuc，但它們的單糖摩爾比差異較大。分子量最大的GLMP1中Xyl最多，其次是Gal、Ara和Fuc，前期研究［17］表明Xyl有助于提高多糖的抗氧化活性。GLMP2含Gal最多，其次是Xyl、Glc和Ara且這3種單糖含量接近，單糖組成分析中Gal含量較多的多糖可以顯著地增強(qiáng)免疫活性［18］。分子量最小的GLMP3中Glc含量最多，其次是Gal，而其他6種單糖含量較少。分子量大的GLMP1和GLMP2中單糖組成種類更豐富，并且表征高生物活性的單糖含量更高。

圖6 GLMP3PMP柱前衍生化的RP—HPLC圖譜Figure 6 RP—HPLC chromatograms of GLMP3by PMP derivatives

表2 3個級分多糖的單糖組成（摩爾比）Table 2 Monosaccharide composition of three polysaccharide fractions

2.4 多糖級分的液相色譜—多角度激光散射聯(lián)用（SEC—MALLS）分析

通過示差折光（RI）檢測器信號和光散射（90°）獲得3個多糖級分的色譜圖，見圖7。SEC—MALLS經(jīng)普適校正測定GLMP1、GLMP2和GLMP3的絕對重均分子量（Mw）分別為4.526×105，4.603×104，3.760×103g/mol，這與2.2中所測得的相對重均分子量有一定差異。HPSEC方法中，葡聚糖和多糖樣品結(jié)構(gòu)有一定的差異性，以葡聚糖為標(biāo)樣測得的相對重均分子量誤差更大，不能準(zhǔn)確表示級分多糖的分子量。SEC—MALLS直接測出多糖樣品圖譜中每個點的絕對分子量，無需進(jìn)行任何色譜柱標(biāo)定和標(biāo)準(zhǔn)品參考，測定結(jié)果更精確。

此外，分子量分布情況可由Mw/Mn的比值顯示，當(dāng)該值越大時，分子量分布就越寬即分散度就越大。對于窄的分子量分布，其Mw/Mn比值接近1［19］。由表3可知，3個多糖級分的Mw/Mn比值分 別為1.559，1.360，1.125，表 明GLMP1和GLMP2中度分散，而GLMP3分子量分布區(qū)間較窄。另外，ASTRA軟件分析可獲得樣品的構(gòu)象，即由分子旋轉(zhuǎn)半徑RMS與分子摩爾數(shù)之間的關(guān)系曲線可得，該關(guān)系曲線用α表示。Wyatt［19］認(rèn)為當(dāng)α值小于或等于0.33時大分子是一個緊密均勻的球形構(gòu)象；而α值在0.2～0.4可以說明大分子為高支化的緊縮鏈構(gòu)象；直線斜率在0.5～0.6，表明大分子是一個無規(guī)則線團(tuán)構(gòu)象。3個級分多糖的α值皆在0.3～0.4，表明 GLMP1、GLMP2和 GLMP3均為緊密且具有高度分枝結(jié)構(gòu)的大分子聚合物，其中GLMP2可能是球形構(gòu)象。

圖7 級分多糖的光散射（LS）和RI檢測器的色譜圖Figure 7 Chromatograms obtained by SEC with LS and RI of three polysaccharide fractions

表3 SEC—MALLS—RI測定多糖級分的分子特性Table 3 Molecular characteristics of three polysaccharide fractions by SEC—MALLS—RI

3 結(jié)論

前期優(yōu)化后的赤芝菌種經(jīng)液體深層發(fā)酵，獲得的靈芝菌絲體粗多糖經(jīng)DEAE－Sepharose CL－6B分離純化得到3個多糖級分GLMP1、GLMP2和GLMP3，HPSEC檢測3個級分多糖純度都較高，可視為均一的多糖級分。PMP衍生化RP—HPLC結(jié)果顯示GLMP1、GLMP2和GLMP3均含有Man、Rha、GalUA、Glu、Gal、Xyl、Ara和 Fuc，與之前報道的靈芝菌絲體多糖的單糖組成略有差異［20］，這可能跟靈芝菌種、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。采用SEC—MALLS—RI測試GLMP1、GLMP2和GLMP3的絕對重均分子量（Mw）分別為4.526×105，4.603×104，3.760×103g/mol，并且根據(jù)分子旋轉(zhuǎn)半徑與分子摩爾數(shù)的關(guān)系曲線斜率α可知，3個多糖級分構(gòu)象可能均為高度緊縮且具有分支結(jié)構(gòu)的聚合物。本研究為赤芝菌絲體多糖的構(gòu)效關(guān)系研究提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，有利于該多糖的產(chǎn)品開發(fā)。

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