馬 偉 戴 軍 陳尚衛(wèi) 朱 松（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 141；.江南大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 141）

玉米低聚肽是以玉米蛋白為主要原料，用酶解法（蛋白酶）生產(chǎn)的相對分子量小于1 000、主要成分為肽的粉末狀物質(zhì)［1］，2010年經(jīng)中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會批準(zhǔn)作為新資源食品開始使用。玉米低聚肽中富含丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸和脯氨酸等［2］，其特殊的氨基酸組成和連接方式賦予玉米肽多種生物活性，如促進(jìn)酒精代謝［3］、保護(hù)酒精性/化學(xué)性肝損傷［4，5］、抗疲勞［6］、抗腫瘤［7］、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性［8］等。

Yamaguchi等［1，3］首先用堿性蛋白酶水解玉米蛋白，得到了有生物活性的玉米肽，并發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)酒精代謝作用，并對其醒酒機(jī)理進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明：玉米肽的醒酒作用源于它可以顯著性提高血清中丙氨酸、亮氨酸的濃度，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的輔酶（NAD＋），進(jìn)而加速血液中乙醇在肝臟中的代謝。

目前，關(guān)于具有醒酒活性玉米低聚肽的報(bào)道多集中于玉米蛋白粉的酶解條件的優(yōu)化，而關(guān)于其醒酒活性肽的氨基酸序列報(bào)道較少，僅 Ma Zhi－li等［9］給出了一種醒酒活性肽的氨基酸序列為 Q－L－L－P－F。為進(jìn)一步研究醒酒活性肽的構(gòu)效關(guān)系，進(jìn)而為開發(fā)高醒酒活性玉米低聚肽產(chǎn)品提供理論依據(jù)，本研究將自制的玉米低聚肽產(chǎn)品經(jīng)凝膠過濾色譜和反相色譜分離分級，以及醒酒活性篩選，獲得醒酒活性較強(qiáng)的級分；該級分再經(jīng)超高效液相色譜—四級桿—飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析，以獲得其氨基酸序列。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)原料

玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM）：粗蛋白含量為62.87%，中食都慶（山東）生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)動物

昆明種健康小白鼠，體重（25±2）g，雄性，蘇州中醫(yī)院研究所。

1.1.3 主要試劑

中溫 α淀粉酶 BAN 480L：480KNU/g，丹麥 Novo公司；

Alcalase 2.4L：2.4AU/g，丹麥 Novo公司；

氧化型輔酶I（NAD＋）：上海國藥集團(tuán)；

乙醇脫氫酶ADH：310U/mg，美國Sigma公司；

SephadesG－15：葡聚糖凝膠，美國GE公司；

乙腈：色譜純，美國Fisher公司；

甲酸：色譜純，美國ROE公司；

乙醇、正丁醇：優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4、明膠、焦磷酸鈉、鹽酸、三氟乙酸、無水乙醇等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)：Avanti J－E型，美國Beckman公司；

雙光紫外可見分光光度計(jì)：TU－1900型，北京普析通用儀器有限公司；

氣相色譜儀：GC－2010型，日本島津公司；

恒流泵：HL－2型，上海滬西分析儀器有限公司；

電腦全自動部分收集器：BSZ－100型，上海滬西分析儀器有限公司；

紫外檢測器：HD－3型，上海滬西分析儀器有限公司；

色譜工作站：SEPU3000型，杭州普惠科學(xué)儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ－10N型，寧波新芝生物科技有限公司；

高效液相色譜儀：Waters 2545型，美國沃特公司；

超高效液相色譜—飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀：Wates Acquity UPLC－Waters MALDI Synapt Q－TOF型，美國沃特公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米低聚肽的制備 因原料中蛋白質(zhì)含量不高，故先用中溫淀粉酶對原料脫淀粉，然后以脫淀粉玉米蛋白粉為原料進(jìn)行酶水解得到玉米粗肽液，再經(jīng)過除雜和脫鹽，最后進(jìn)行低溫噴霧干燥得到玉米低聚肽成品（COP）。玉米低聚肽的制備工藝流程：

1.2.2 玉米低聚肽的理化指標(biāo) 按 QB/T 4707—2014執(zhí)行。

1.2.3 體外醒酒活性——乙醇脫氫酶（ADH）活力的測定

參照文獻(xiàn)［10］修改如下：取5mL小管，加入pH 8.8的焦磷酸鈉緩沖液1.5mL，27mmol/L氧化型輔酶I（NAD＋）1.0mL，體積分?jǐn)?shù)為 11.5%的乙醇溶液 0.5mL，試樣（0.1mg/mL COP溶液或超純水）0.1mL，混勻后置于25℃水浴鍋中溫浴5min，之后向管中加入25℃溫浴的ADH（0.25U/mL）0.1mL。混勻后立即測定其吸光度（A340nm）值，每隔10s讀數(shù)一次，直至每分鐘吸光度的增大值達(dá)到穩(wěn)定為止。取最初線性部分計(jì)算每分鐘還原型輔酶Ⅰ（NADH）的生成量，ADH的活力（U）以每分鐘生成1μmol NADH時所需的酶量表示。ADH酶活按式（1）計(jì)算：

式中：

EADH——ADH酶活，U；

ΔA——340nm處每分鐘吸光度的增加值；

3.2——反應(yīng)液總體積，mL；

W——酶液中含酶量，mg/mL；

6.2——NADH在340nm處的摩爾吸光系數(shù)。

1.2.4 玉米低聚肽醒酒動物試驗(yàn) 醒酒動物試驗(yàn)及量效關(guān)系試驗(yàn)參照文獻(xiàn)［11］。將昆明種雄性小鼠，飼養(yǎng)1周后隨即分為5組，每組10只。5組分別為空白組（陰性對照）、模型組（陽性對照）、COP低劑量組（0.2mg/g·BW）、COP中劑量組（0.4mg/g·BW）、COP高劑量組（0.8mg/g·BW）。采用灌胃的方式給予COP，灌胃前禁食12h，空白組和模型組分別給予等體積的生理鹽水。30min后除空白組外，其余4組均灌胃50%（V/V）乙醇0.012mL/g·BW，空白組則灌胃等體積的生理鹽水，兩次灌胃總體積不超過0.03mL/g·BW。1h后眼眶取血，將所取血樣于37℃水浴恒溫30min，立即以4 000r/min離心5min取血清，在血清中加入等體積的10%TCA和4μL/mL的正丁醇（內(nèi)標(biāo)物），再以4 000r/min離心5min，取上清液供測定血清中乙醇濃度用。

將上述處理好的血清樣品用氣相色譜法測定乙醇的濃度，色譜條件：檢測器：FID，溫度250℃；DB－23毛細(xì)管色譜柱：60m×320mm×25μm，柱溫70℃；流量：氫氣47mL/min，空氣400mL/min，氮?dú)?.5mL/min。

1.2.5 凝膠過濾色譜分離COP 色譜分離柱自裝，填料為Sephadex G－15，柱尺寸：60cm×2.6cm；洗脫液：超純水；洗脫流速：1.0mL/min；上樣量：COP 15mL（30mg/mL）；檢測波長：220nm。結(jié)合SEPU3000色譜工作站給出的色譜圖，每6min收集1管，按照分子量大小分為不同級分，將各級分經(jīng)冷凍干燥后得到固形物，然后分別測定其體外醒酒活性，活性最強(qiáng)的級分用于后續(xù)進(jìn)一步分離純化。

1.2.6 制備型反相高效液相色譜分離純化 將經(jīng)冷凍干燥制得的1.2.5中活性最強(qiáng)的級分，用 Waters 2545制備型高效液相色譜（RP—HPLC）進(jìn)一步分離純化。色譜柱為 Waters xBridgeTMPrep C18（250mm×19mm，5μm）；柱溫為室溫（20℃左右），進(jìn)樣量500μL，樣品濃度50mg/mL，流動相流速10mL/min，紫外檢測波長220nm；流動相：A為乙腈（0.05%TFA），B為超純水（0.05%TFA）；梯度洗脫條件：0～30min，5%A～20%A；30～50min，20%A～50%A；50～53min，50%A；53～55min，50%A～5%A；55～60min，5%A。將集分經(jīng)冷凍干燥后得到固形物，分別測定其ADH激活率。ADH激活率按式（2）計(jì)算：

式中：

R——ADH激活率，%；

E加肽——玉米低聚肽組ADH酶活，U；

E空白——空白組ADH酶活，U。

1.2.7 UPLC—Q—TOF—MS分離分析 將1.2.6中體外醒酒活性最強(qiáng)的凍干組分，經(jīng)UPLC—Q—TOF—MS進(jìn)一步分離分析。

（1）液相條件：Wates Acquity UPLC超高效液相色譜儀，色譜柱為 Waters xBridgeTMBEH 130C18（150mm×2.1mm，1.7μm）；柱 溫 45 ℃，進(jìn) 樣 量 1μL，進(jìn) 樣 濃 度0.1mg/mL，流動相流速0.3mL/min，PDA檢測器，流動相：A為乙腈，B為超純水（0.1%甲酸）；洗脫條件：0～1min，2%A；1～23min，2%A～40%A；23～25min，40%A～80%A；25～26min，80%A；26～30min，80%A～2%A。

（2）質(zhì)譜條件：Waters MALDI Synapt Q—TOF，離子化方式ESI＋；毛細(xì)管電壓3.0kV；取樣錐孔電壓30V；離子源溫度100℃；脫溶劑溫度400℃；脫溶劑氣流500L/h；錐孔氣流50L/h；碰撞能量6/25V；倍增器電壓1 800V。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS軟件，所有數(shù)據(jù)以平均值（3次重復(fù)）或者以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間經(jīng)t檢和方差分析對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米低聚肽的理化指標(biāo)

由表1可知，通過比較可以發(fā)現(xiàn)自制玉米低聚肽的各項(xiàng)值均優(yōu)于QB/T 4707—2014中的要求。

表1 玉米低聚肽理化指標(biāo)Table 1 Physical and chemical indicators of corn oligopetides%

2.2 體外醒酒試驗(yàn)

經(jīng)ADH活力測定，自制玉米低聚肽COP的體外醒酒活性——ADH激活率為（41.73±1.9）%，優(yōu)于市售某玉米低聚肽的ADH激活率（35.69±1.4）%，說明自制的玉米低聚肽COP具有高效的體外醒酒活性。

2.3 玉米低聚肽醒酒動物試驗(yàn)

圖1 不同劑量玉米低聚肽對小鼠血清中乙醇含量的影響Figure 1 Effect of corn peptides on serum ethanol concentration in mice

由圖1可知，與陽性對照組比較，隨著灌胃COP劑量的增加，小鼠血清中乙醇含量不斷降低，當(dāng)COP的劑量為0.2mg/g·BW時，小鼠血清中乙醇含量顯著降低（P＜0.05），當(dāng)COP的劑量為0.4mg/g·BW時，小鼠血清中乙醇含量極顯著降低（P＜0.01），當(dāng)COP的劑量為0.8mg/g·BW 時，血醇含量降低達(dá)到極顯著水平（P＜0.001），乙醇含量降低率達(dá)到70.02%。通過動物試驗(yàn)表明，COP在小鼠體內(nèi)有高醒酒活性，同時不難發(fā)現(xiàn)玉米低聚肽的劑量與小鼠血清中乙醇含量的降低呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

2.4 凝膠過濾色譜分離分級

凝膠過濾色譜（Sephadex G－15）分離COP的洗脫曲線見圖2。按照分子量大小分為5個級分，分別定義為COPⅠ、COPⅡ、COPⅢ、COPⅣ、COPⅤ。5個級分中COPⅢ的體外醒酒活性最強(qiáng)，其ADH激活率為（37.82±1.7）%。多次收集COPⅢ，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮及冷凍干燥后得到固形物用于后續(xù)分離純化。

圖2 Sephadex G－15分離COPFigure 2 Separation of COP by Sephadex G－15

2.5 制備型RP—HPLC分離分級

將經(jīng)凝膠過濾色譜（Sephadex G－15）分離得到的活性較強(qiáng)級分COPⅢ進(jìn)一步進(jìn)行反相色譜分離，可分成如圖3所示的21個級分。分別收集這21個級分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮及冷凍干燥后測定其體外醒酒活性，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，17號級分的體外醒酒活性最高，其ADH激活率為（45.73±2.3）%，組 分 14，15，16，19，20，21 的ADH激活率均超過25%～40%。17號級分用于下一步UPLC—Q—TOF—MS分析，以期得到其氨基酸序列。

圖3 制備反相高效液相分離COPⅢ色譜圖Figure 3 The chromatogram of COPⅢseparated by Preparative RP—HPLC

圖4 反相高效液相分離組分的體外醒酒活性Figure 4 The antialcoholism activity in vitro of the fractions separated by RP—HPLC

圖5 COPⅢ－17級分的反相超高效液相色譜圖Figure 5 The RP—UPLC profile of COPⅢ－17

圖6 COPⅢ－17主峰（RT＝14.86）的 Q—TOF二級質(zhì)譜圖（m/z＝899.5）Figure 6 MS/MS spectrum of the major component of COPⅢ－17

2.6 活性級分的氨基酸序列分析

將17號級分經(jīng)UPLC—Q—TOF—MS分離分析，得到UPLC—UV圖譜和其主成分（RT＝14.86min）的Q—TOF二級質(zhì)譜圖，見圖5、6。采用Biolynx軟件對該主成分的碎片離子進(jìn)行解析，得到其氨基酸序列為P－Y－L－P－L－L－P－S，斷裂模式見圖6。

3 結(jié)論

經(jīng)體外ADH活性試驗(yàn)及動物試驗(yàn)表明，在本研究給出的水解條件下制得的玉米低聚肽產(chǎn)品COP具有較高的體內(nèi)外醒酒活性，COP的劑量與小鼠血醇含量的降低呈現(xiàn)明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)UPLC—Q—TOF—MS分析，初步得到最強(qiáng)活性組分的分子量為899.5，其氨基酸序列為：P－Y－LP－L－L－P－S。本研究為進(jìn)一步開發(fā)玉米蛋白資源及高醒酒活性玉米低聚肽產(chǎn)品提供了新的依據(jù)。

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