楊云舒，李 榮，姜子濤*

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化廣棗黃酮的微波提取工藝及黃酮的提純

楊云舒，李 榮，姜子濤*

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法確定了微波輔助提取廣棗黃酮的最佳條件：提取溫度75 ℃、液料比62∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)62%、微波功率500 W和提取時(shí)間7 min。在此條件下，黃酮得率遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)所報(bào)道的方法。通過動(dòng)態(tài)法確定了AB-8型大孔樹脂純化廣棗黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)：樣品液流速2 BV/h、樣品液pH 2、洗脫液流速3 BV/h、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。同時(shí)利用制備色譜對(duì)廣棗黃酮進(jìn)行純化，高效液相色譜法分析結(jié)果證明，制備色譜用于純化廣棗黃酮具有可行性。

廣棗；響應(yīng)面分析；大孔樹脂；制備色譜

廣棗是漆樹科植物南酸棗（Choerospondias axillaris (Roxb.) Burtt et Hill）的干燥果實(shí)，又名南酸棗、五眼果、山棗等，在我國有廣泛的分布[1]。我國的許多地區(qū)都有生食廣棗的習(xí)慣，因其具有較高的保健功效，被視為食品加工的優(yōu)良原料[2]。廣棗具有養(yǎng)心安神的功效，并且對(duì)抗心律失常、改善心肌缺血具有明顯的效果，常被用于臨床心血管疾病的治療[3-6]，2010版《中華人民共和國藥典》[7]已將其收錄。經(jīng)過國內(nèi)外的一些學(xué)者對(duì)于廣棗的化學(xué)成分所進(jìn)行的系列研究，目前已知其果實(shí)中含有黃酮類化合物、酚酸類化合物、甾醇、脂肪酸、氨基酸以及鉀、鈣和鎂等多種成分[8-14]。其中，廣棗中大量的黃酮類成分被認(rèn)為是有效成分，具有多種生理活性。目前，廣棗黃酮 的提取方法主要有回流法和超聲提取法[15-18]，此外，易躍能等[19]使用了較適宜于工業(yè)生產(chǎn)的滲漉法進(jìn)行廣棗黃酮的提取，谷福根等[20]將β-環(huán)糊精選擇性提取法引入廣棗黃酮的提取研究中，然而它們均在不同程度上存在著成本較高、提取不完全、耗時(shí)過長(zhǎng)等不足。而對(duì)于廣棗黃酮的分離純化還鮮有研究[21]。

本實(shí)驗(yàn)利用微波輔助快速提取技術(shù)，結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化廣棗總黃酮的提取工藝，并采用大孔吸 附樹脂和制備色譜進(jìn)行純化，為廣棗黃酮的開發(fā)和利用提供了一種簡(jiǎn)單、有效的方法，并為廣棗在食品和藥品領(lǐng)域的有效應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣棗，產(chǎn)地西藏，去核后粉碎約20 目備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（分析純） 北京化學(xué)試劑公司；甲醇（色譜純） 天津市科密歐化學(xué) 試劑有限公司；AB-8大孔樹脂 南開大學(xué)化工廠；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1104N型電子天平 上海精密儀器有限公司；Multi SYNTH微波合成儀 意大利Milestone公司；Alpha-1500紫外-可見分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司；U-3900紫外-可見分光光度計(jì) 日本日立公司；Grace RevelerisTM全息快速純化色譜系統(tǒng)、SSI 1500高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配備四元梯度泵） 美國Alltech公司；RE52-86A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照文獻(xiàn)[22-23]的方法，準(zhǔn)確吸取0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于10 mL比色管中，分別加入5%的NaNO2溶液0.40 mL，搖勻并放置6 min，再加入10% Al(NO3)3溶液0.40 mL，搖勻，放置6 min，然后加入4%的 NaOH溶液4.0 mL，用30%的乙醇溶液定容至刻度并搖勻，靜置10 min后于508 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，參比為試劑空白。得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度ρ（mg/mL）與吸光度A的回歸方程為：A=10.483ρ-0.001 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

1.3.2 廣棗黃酮的微波提取

稱取0.5 g廣棗粉末，加入微波合成儀的圓底燒瓶中，以乙醇溶液為溶劑，在設(shè)定條件下按照一定液料比進(jìn)行微波萃取，對(duì)提取液進(jìn)行減壓抽濾，所得濾液即為廣棗黃酮提取液。提取液經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)后冷凍干燥，得到廣棗粗黃酮粉末。準(zhǔn)確稱取粗黃酮粉末0.5 g，加入少量乙醇溶解后定容至500 mL，得到1.0 mg/mL的廣棗粗黃酮儲(chǔ)備液，備用。

1.3.3 廣棗黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取1.0 mL提取液，以相應(yīng)提取液作為參比，按照1.3.1節(jié)方法顯色，測(cè)定其在波長(zhǎng)508 nm處的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到黃酮質(zhì)量濃度，按照下式計(jì)算黃酮得率：

式中：ρ為由回歸方程計(jì)算出的樣品液中黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為廣棗粉末質(zhì)量/mg。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

以乙醇水溶液為溶劑，準(zhǔn)確稱取0.5 g廣棗粉末，分別改變提取溫度（固定液料比40∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、微波功率400 W、提取時(shí)間7 min）、液料比（固定提取溫度75 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、微波功率400 W、提取時(shí)間7 min）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（固定提取溫度75 ℃、液料比60∶1、微波功率400 W、提取時(shí)間7 min）、提取時(shí)間和微波功率（固定提取溫度75 ℃、液料比60∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%），進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定提取液在最大吸收波長(zhǎng)262 nm處的吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到黃酮得率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取提取溫度、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)作為3 個(gè)影響因素，采用Box-Behnken原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)方案，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，其中，中心試驗(yàn)重復(fù)3 次。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果及水平選擇的一般規(guī)律，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素及水平Table1 Factors and levels used in in the response surface design

1.3.6 大孔樹脂純化廣棗黃酮條件的確定

1.3.6.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

將AB-8大孔樹脂于95%的乙醇溶液中充分浸泡24 h，用蒸餾水洗至無醇味，去除醇溶性雜質(zhì)。然后用5%的HCl溶液浸泡3 h，洗至流出液的pH值為中性，再用5%的NaOH溶液浸泡3 h，洗至pH值為中性后浸泡備用[24]。

1.3.6.2 樣品液流速的確定

準(zhǔn)確稱取處理過的AB-8型大孔樹脂6.0 g，采用濕法裝柱，分別以1.5、2、3 BV/h的流速加入質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的樣品液，每隔3 mL測(cè)定流出液在波長(zhǎng)262 nm處的吸光度，當(dāng)流出液的吸光度達(dá)到樣品液的1/10（泄漏點(diǎn)）時(shí)停止上樣。

1.3.6.3 樣品液pH值的確定

將pH值分別為2、4、6的質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的樣品液以2 BV/h的流速上樣，每隔3 mL測(cè)定流出液在波長(zhǎng)262 nm處的吸光度，以泄漏點(diǎn)最遲為最佳。

1.3.6.4 洗脫液流速的確定

取濕法填裝的AB-8型大孔吸附樹脂6.0 g，按以上確定的吸附條件上樣至泄漏點(diǎn)，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液分別以1、2、3 BV/h的流速進(jìn)行洗脫，每隔3 mL測(cè)定流出液在波長(zhǎng)262 nm處的吸光度，繪制洗脫曲線。

1.3.6.5 洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定按以上確定的吸附條件上樣至泄漏點(diǎn)，分別用體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%和80%的乙醇溶液以3 BV/h的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并掃描其在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜。

1.3.7 制備色譜純化廣棗黃酮

將2.5 g粗黃酮溶解得到質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的粗黃酮溶液。制備色譜條件：柱填料為40 g Reveleris?RP C18Cartridge，流動(dòng)相為0.1%乙酸溶液（A）和甲醇（B），流速為6 mL/min，進(jìn)樣量為20 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為262 nm。梯度洗脫條件為：0～9 min，0～30% B；9～12 min，30%～75% B；12～27 min，75%～100% B；27～30 min，100% B。

1.3.8 純化效果的檢測(cè)

采用HPLC法測(cè)定純化前后黃酮的純度，分別將經(jīng)大孔樹脂和制備色譜純化的廣棗黃酮溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇，冷凍干燥得到純化后的廣棗黃酮粉末。分別用50%的甲醇溶解，并稀釋至1 mg/mL，使用HPLC進(jìn)行分析。分析條件：ZorbaxSB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm），流動(dòng)相：甲醇（A）、水（B）、1%乙酸溶液（C），流速0.9 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫條件為：0～40 min，0～90% A，C溶液一直維持在10%。檢測(cè)波長(zhǎng)為262 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Design-Expert對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度的影響

保持其他條件不變，分別測(cè)定在提取溫度60、65、70、75、80 ℃條件下的廣棗黃酮得率，結(jié)果見圖1。

圖1 提取溫度對(duì)廣棗黃酮得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of fl avonoids

由圖1可知，在60～80 ℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，黃酮得率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，并在75 ℃時(shí)達(dá)到最高。這可能是因?yàn)闇囟鹊纳呒觿×朔肿舆\(yùn)動(dòng)，在一定溫度范圍內(nèi)，隨溫度的升高，黃酮在乙醇中的溶解度增大，但溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致黃酮甙分子的結(jié)構(gòu)破壞，從而降低黃酮得率，因此選擇廣棗黃酮的提取溫度為75 ℃。

2.1.2 液料比的影響

在其他條件不變的情況下，分別測(cè)定在液料比30∶1、40∶1、50∶1、60∶1和70∶1條件下的廣棗黃酮得率，結(jié)果見圖2。

圖2 液料比對(duì)廣棗黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ratio of liquid to material on the yield of fl avonoids

從圖2可以看出，在液料比30∶1～70∶1范圍內(nèi)，黃酮類物質(zhì)的得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。這是因?yàn)橐毫媳冗^大會(huì)導(dǎo)致溶液質(zhì)量濃度減小，從而影響到原料對(duì)微波能的吸收，故選擇液料比為60∶1。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

在其他條件不變的情況下，分別測(cè)定在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%和90%條件下的廣棗黃酮得率，結(jié)果見圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)廣棗黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of fl avonoids

由圖3可以看出，廣棗黃酮的得率在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)達(dá)到最高。這是因?yàn)楫?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)與廣棗中黃酮類化合物的極性相近，根據(jù)“相似相溶”原理，此時(shí)廣棗黃酮在其中的溶解度最大，更有利于溶出，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.1.4 提取時(shí)間及微波功率的影響

在其他條件不變的情況下，分別測(cè)定在不同提取時(shí)間及微波功率條件下的廣棗黃酮得率，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間及微波功率對(duì)廣棗黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time and microwave power on the yield of fl avonoids

提取時(shí)間可影響溶劑與細(xì)胞內(nèi)黃酮類物質(zhì)接觸的充分程度，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，溶劑能夠更加充分的滲透到細(xì)胞內(nèi)部溶解黃酮，而提取時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溫度過高，氧化黃酮類物質(zhì)。微波功率的增大會(huì)使原料吸收的微波能量增多，從而使黃酮更易進(jìn)入溶劑中。從圖4可以看出，在500 W條件下提取7 min時(shí)與400 W提取9 min的提取率相當(dāng)，從節(jié)約時(shí)間考慮，選擇在微波功率500 W條件下提取7 min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

表2 單因素試驗(yàn)的方差分析Table2 Analysis of variance for single factors

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table3 Response surface design with experimental results

通過SPSS處理單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定影響廣棗黃酮得率的各因素的大小關(guān)系為：液料比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞微波功率＞提取時(shí)間，其中液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度3 個(gè)因素顯著影響黃酮得率，其他兩個(gè)因素的影響不顯著（表2）。這是因?yàn)槲⒉ㄝo助提取中，起始功率越大，達(dá)到目標(biāo)溫度的時(shí)間就越短；當(dāng)達(dá)到目標(biāo)溫度后，微波合成儀會(huì)自動(dòng)調(diào)整功率以維持此溫度。因此，在廣棗黃酮的提取中，提取溫度、微波功率、提取時(shí)間三者表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。在應(yīng)用響應(yīng)面分析進(jìn)行最優(yōu)條件分析時(shí)，設(shè)定微波功率為500 W，提取時(shí)間為7 min，以確定最優(yōu)工藝條件。試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

2.2.1 二次回歸方程擬合和方差分析

利用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到以廣棗黃酮得率為響應(yīng)值，對(duì)自變量提取溫度（A）、液料比（B）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）三因素的回歸方程為：

Y=-202.697 08＋5.077A＋0.513 75B＋0.364 5C＋0.000 65AB＋0.001 25AC＋0.000 625BC-0.034 383A2-0.004 85B2-0.004C2

表4 回歸方程的方差分析Table4 Analysis variance of regression equation

由表4可知，模型的P=0.000 2＜0.0 1，說明模型變量與3 個(gè)自變量之間的線性關(guān)系極顯著，即此方法是可靠的。失擬項(xiàng)P=0.247 6＞0.05，不顯著，說明該方程的擬合情況良好，可以用其進(jìn)行廣棗黃酮得率的預(yù)測(cè)和分析。R2=0.980 8，表明只有1.92%的試驗(yàn)不能用此方程確定，在試驗(yàn)中沒有其他顯著因素的影響，條件是合適的[25]。對(duì)回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果表明，方程的一次項(xiàng)A、B、C及二次項(xiàng)A2、B2和C2的P值均小于0.01，極顯著，而交互項(xiàng)不顯著，說明此方程的擬合較充分。各因素對(duì)廣棗黃酮得率的影響依次為：液料比＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

對(duì)表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，去除不顯著的交互項(xiàng)AB、AC和BC，得到廣棗黃酮得率對(duì)3 個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程：y=-213.497 08＋5.191A＋0.6B＋0.495 75C-0.034 383A2-0.004 85B2-0.004C2。優(yōu)化后，模型（P＜0.000 1）極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，決定系數(shù)R2=0.988 6，調(diào)整系數(shù)R2= 0.968 2，預(yù)測(cè)系數(shù)R2=0.845 3，說明測(cè)定值（16.41%）與模型預(yù)測(cè)值（16.38%）之間具有良好的相關(guān)度。變異系數(shù)0.66%，說明模型重復(fù)性良好。提取溫度、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)3 個(gè)因素兩兩交互作用對(duì)于廣棗黃酮得率的三維空間曲面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graphs showing the effect of three extraction parameters on the yield of fl avonoids

2.2.2 最優(yōu)條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過回歸模型預(yù)測(cè)，給出的廣棗黃酮提取的最佳工藝條件為提取溫度75.55 ℃、液料比62.1∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)62.28%、微波功率500 W、提取時(shí)間7 min，在此條件下廣棗黃酮得率的預(yù)測(cè)值為16.38%?？紤]到實(shí)驗(yàn)的可操作性，修正最佳工藝條件為，提取溫度75 ℃、液料比62∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)62%、微波功率500 W和提取時(shí)間7 min。在此修正條件下進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，廣棗黃酮實(shí)際得率為16.41%，相對(duì)誤差為0.2%，與預(yù)測(cè)值接近?？梢娢⒉ǚ纱蟠蟮亟档忘S酮的提取時(shí)間，由常規(guī)的2～3 h降低到現(xiàn)在的7 min，且黃酮得率遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)所報(bào)道的回流法、超聲提取法、滲漉法、β-環(huán)糊精選擇性提取法等的結(jié)果[15-20]。證明由響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的廣棗黃酮提取條件是可靠的。

2.3 大孔樹脂純化廣棗黃酮

2.3.1 樣品液流速的確定

圖6 樣品液流速對(duì)吸附效果的影響Fig.6 Effect of sample loading fl ow rate on adsorption effi ciency

由圖6可以看出，樣品液流速為2 BV/h時(shí)泄漏點(diǎn)（吸光度為1.09）出現(xiàn)的最晚。這是因?yàn)闃悠芬毫魉龠^快會(huì)使樹脂產(chǎn)生不 完全吸附，部分未吸附的黃酮分子隨樣品液流出，降低了樹脂的吸附效率。因此，選擇樣品液流速為2 BV/h。

2.3.2 樣品液pH值的確定

圖7 樣品液pH值對(duì)吸附效果的影響Fig.7 Effect of sample pH on adsorp tion effi ciency

由圖7可知，在樣品液pH值為2時(shí)，大孔樹脂的吸附能力最強(qiáng)，隨著pH值的升高，大孔樹脂的吸附能力降低。這是因?yàn)辄S酮類化合物的結(jié)構(gòu)上具有酚羥基，帶有一定酸性。黃酮在酸性條件下主要以分子形式存在，有利于大孔樹脂的吸附。因此選擇樣品液pH值為2。

2.3.3 洗脫液流速的確定

圖8 洗脫液流速對(duì)洗脫效果的影響Fig.8 Effect of eluent fl ow rate on elution effi ciency

如圖8所示，洗脫液流速為3 BV/h時(shí)峰的吸收強(qiáng)度最大，且3 個(gè)流速條件下幾乎均無拖尾現(xiàn)象，解吸率均達(dá)到90%以上。因?yàn)榱魉龠^慢會(huì)導(dǎo)致時(shí)間延長(zhǎng)、生產(chǎn)效率降低等問題，所以選擇洗脫液流速為3 BV/h。

2.3.4 洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

圖9 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)洗脫液的紫外吸收光譜Fig.9 UV absorption spectra of eluates with different concentrations of ethanol

由圖9可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%和80% 時(shí)，洗脫下的黃酮最多；但在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，流出液的吸收曲線峰形有了明顯的變化，表明有極性雜質(zhì)被洗脫下來。再加之從經(jīng)濟(jì)效益的角度考慮，應(yīng)盡可能地降低有機(jī)溶劑的使用量，因此選擇洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。在所擬定的最佳條件下，經(jīng)大孔樹脂純化后黃酮含量由純化前的28.5%增加到67.3%，黃酮含量提升到純化前的2.36 倍，純化效果還是非常明顯的。

2.4 制備色譜分離廣棗黃酮

圖10 制備色譜純化廣棗黃酮（波長(zhǎng)262 nm）Fig.10 Purifi cation of Choerospondias axillaris fl avonoids by preparative chromatography (262 nm)

圖10 顯示了廣棗黃酮的制備色譜分離結(jié)果，制備色譜將廣棗黃酮分為2 個(gè)組分，即5～8 min為組分1，17.5～24.5 min為組分2。兩個(gè)組分間的極性有顯著區(qū)別。

2.5 制備色譜分離效果

由圖11可以看出，經(jīng)大孔樹脂純化得到色譜圖與制備色譜分離得到的兩個(gè)組分的色譜圖能一一對(duì)應(yīng)，并且在質(zhì)量濃度相同的情況下，各組分的響應(yīng)值均高于分離前純化黃酮。這說明制備色譜作為一種快速高效的純化手段，不僅不會(huì)丟失成分，而且 還能夠起到初步分離的作用，每一組分的純度也都得到了顯著提高。但是由于提取物中含有部分寡聚鞣花酸[5]，在進(jìn)行柱色譜分離時(shí)，有一些寡聚物會(huì)在樹脂上降解，極性也隨之發(fā)生改變，而樹脂分離純化的原理就是依據(jù)被吸附物質(zhì)和樹脂的極性，所以很難利用在樹脂上反復(fù)進(jìn)行色譜分離的方法得到純化物[26]。

圖11 大孔樹脂和制備色譜純化廣棗黃酮的HPLC圖Fig.11 HPLC profi les of Choerospondias axillaris fl avonoids after purifi cation by AB-8 resin and preparative chromatography

3 結(jié) 論

本研究利用單因素試驗(yàn)篩選關(guān)鍵因素，通過響應(yīng)面分析法確定微波輔助提取廣棗黃酮的最佳條件：提取溫度75 ℃、液料比62∶1、乙 醇體積分?jǐn)?shù)62%、微波功率500 W、提取時(shí)間7 min。通過動(dòng)態(tài)法確定了AB-8型大孔樹脂純化廣棗黃酮的最 佳工藝參數(shù)：樣品液流速2 BV/h、樣品液pH 2、洗脫液流速3 BV/h、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。經(jīng)制備色譜純化分離出兩個(gè)組分。對(duì)比兩種純化方式，制備色譜不僅能夠高效快速地純化廣棗黃酮，還能對(duì)黃酮組分進(jìn)行初步分離。HPLC分析結(jié)果證明：制備色譜用于分離純化廣棗黃酮具有可行性。本研究初步確定了微波輔助提取廣棗黃酮和大孔樹脂、制備色譜純化廣棗黃酮的工藝參數(shù)，為進(jìn)一步進(jìn)行生物活性的研究及成分分析奠定了基礎(chǔ)，為廣棗黃酮的利用提供了一定的理論依據(jù)。

[1] 王曉琴, 王力偉, 趙巖, 等. 廣棗的化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(13): 281-285. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201413056.

[2] 劉曉庚, 陳梅梅, 丁悅琴, 等. 南酸棗果的幾種加工方法[J]. 林業(yè)科技開發(fā), 1995, 9(1): 44-46.

[3] LI Chunmei, HE Jie, GAO Yonglin, et al. Preventive effect of total flavones of Choerospondias axillaries on ischemia/reperfusioninduced myocardial infarction-related MAPK signaling pathway[J]. Cardiovascular Toxicolog y, 2014, 14(2): 1 45-152.

[4] 王鳳華, 楊玉梅, 徐繼輝, 等. 蒙藥廣棗3 種黃酮類成分對(duì)烏頭堿所致心律失常的作用比較[J]. 中國中藥雜志, 2005, 30(14): 1096-1098.

[5] 張浩楠, 楊玉梅, 鄔國棟, 等. 蒙藥廣棗抗心律失常作用有效成分的分離[J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 29(3): 1-4.

[6] 李增晞, 田風(fēng)居, 吳秀英, 等. 復(fù)方廣棗注射液對(duì)動(dòng)物耐缺氧和急性心肌缺血的保護(hù)作用[J]. 中藥通報(bào), 1985, 10(3): 42-44.

[7] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典: 一部[M]. 2010版. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 41.

[8] 鄧麗嘉, 王月梅, 顧維彰, 等. 蒙藥廣棗的化學(xué)成分研究[J]. 中草藥, 1989, 20(3): 8-9.

[9] 連珠, 張承忠, 李沖, 等. 蒙藥廣棗化學(xué)成分的研究[J]. 中藥材, 2003, 26(1): 23-24.

[10] 唐麗, 李國玉, 楊柄友, 等. 廣棗化學(xué)成分的研究[J]. 中草藥, 2009, 40(4): 541-543.

[11] 申旭霽, 格 日力, 王金輝, 等. 廣棗的化學(xué)成分[J]. 河南大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2009, 28(3): 196-199.

[12] 王乃利, 倪艷, 陳英杰, 等. 廣棗活血有效成分的研究[J]. 沈陽藥學(xué)院學(xué)報(bào), 1987, 4(3): 203.

[13] ZHAO Xinfeng, ZHANG Weijin, KONG Shanshan, et al. A valid assay for the pharmacokinetic study of gallic acid from Choerospondiatis fructus in rabbit plasma by LC/MS/MS[J]. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 2007, 30(2): 235-244.

[14] PAUDEL K C, EDER R, PAAR E, et al. Chemical composition of Lapsi (Choerospondias axillaris) fruit from Nepal[J]. Mitteilungen Klosterneuburg, 2002, 52(1/2): 45-53.

[15] 巴根那, 吉林白乙, 白玉霞, 等. 正交設(shè)計(jì)研究廣棗總黃酮提取工藝[J].中成藥, 2000, 22(4): 253-255.

[16] 樊海燕, 賽音, 敖登高娃, 等. 廣棗中黃酮類化合物提取工藝研究[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2005, 36(1): 81-83.

[17] WANG Hua, GAO Xiangdong, ZHOU Gaochao, et al. In vitro and in vivo antioxidant activity of aqueous extract from Choerospondias axillaris fruit[J]. Food Chemistry, 2008, 106: 888-895.

[18] 孫占才, 趙丹慶, 劉鑫, 等. 蒙藥廣棗、麻黃、錦草中總黃酮的提取及含量的測(cè)定[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 23(1): 19-21.

[19] 易躍能, 楊華, 趙勇, 等. 滲漉法提取廣棗中黃酮類成分的工藝研究[J].中國中藥雜志, 2010, 35(14): 1806-1808.

[20] 谷福根, 韓磊, 孟根達(dá)來, 等. β-環(huán)糊精選擇性提取廣棗總黃酮的工藝研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2011, 22(1): 110-114.

[21] 徐金龍. 南酸棗皮黃酮類化合物的提取、純化及其功能性研究[D].江西: 南昌大學(xué), 2013.

[22] 黎瑞汝, 蘇智斌, 陳曦, 等. 正交試驗(yàn)優(yōu)選廣棗提取工藝[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑 學(xué)雜志, 2011, 17(10): 47-49.

[23] 侯學(xué)敏, 李林霞, 張直峰, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(6): 124-128.

[24] 楊立琛, 李榮, 姜子濤, 等. 大孔吸附樹脂純化花椒葉總黃酮的研究[J].中國調(diào)味品, 2012, 37(7): 30-35.

[25] 袁志發(fā), 周靜芋. 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析[M]. 北京: 高等教育出版社, 2000: 381.

[26] DURAN-LARA E F, LOPEZ-CORTES X A, CASTRO R I, et al. Experimental and theoretical binding affinity between polyvinylpolypyrrolidone and selected phenolic compounds from food matrices[J]. Food Chemistry, 2015, 168: 464-470.

Optimization of Microwave-Assisted Extraction by Response Surface Analysis and Purifi cation of Flavonoids from Choerospondias axillaris Fruit

YANG Yunshu, LI Rong, JIANG Zitao*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

The optimal conditions for microwave-assisted extraction of fl avonoids from the fl esh of Choerospondias axillaris fruits were e stablished by using single factor experiments and response surface analysis as follows: extraction temperature, 75 ℃; ratio of solvent to material, 62:1 (mL/g); ethanol concentration, 62%; microwave power 500 W; and extraction time, 7 min. Under the proposed conditions, the yield of flavonoids was much higher than that obtained from some methods reported in the literature. The optimal adsorption/desorption conditions for purifying the crude flavonoids with AB-8 macroporous adsorbent resin were determined as follows: the extract solution at pH 2 was passed through the column at a fl ow rate of 2 bed volumes/h (BV/h), and then the column was eluted with 60% al cohol at 3 BV/h. The purifi cation of crude fl avonoids from C. axillaris was also investigated using preparative chromatography and the feasibility was confi rmed by the results of HPLC analysis.

Choerospondias axillaris; response surface analysis; macroporous resin; preparative chromatography

TS202.3

A

1002-6630（2015）22-0018-07

10.7506/spkx1002-6630-201522004

2015-03-21

天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（12JCZDJC34100）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（TD12-5049）

楊云舒（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称诽砑觿?。E-mail：yangys019@hotmail.com

*通信作者：姜子濤（1956—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称诽砑觿?。E-mail：ztjiang@tjcu.edu.cn