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        響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波輔助提取石榴皮中三萜類化合物工藝及動力學(xué)分析

        2015-12-20 08:53:51王占一鄭丹丹王京龍金美花張立華王玉海
        食品科學(xué) 2015年22期
        關(guān)鍵詞:工藝模型

        王占一,鄭丹丹,王京龍,金美花,張立華,王玉海

        (1.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東 棗莊 277160;2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,天津 300070)

        響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波輔助提取石榴皮中三萜類化合物工藝及動力學(xué)分析

        王占一1,鄭丹丹1,王京龍1,金美花2,張立華1,王玉海1

        (1.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東 棗莊 277160;2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,天津 300070)

        探討了超聲波輔助提取石榴皮中三萜類化合物的工藝條件,以三萜類化合物得率為考察指標(biāo),乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率和超聲時間為試驗因素,通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設(shè)計對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上,建立4 種數(shù)學(xué)模型對提取過程的動力學(xué)進(jìn)行研究,采用決定系數(shù)(R2)、精準(zhǔn)因子(Af)、偏差因子(Bf)和根平均方差4 種模型評價參數(shù)對模型的適用性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:三萜類化合物的最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)71.2%、料液比1∶20.2、超聲功率318 W、超聲時間36.7 min,此條件下的三萜類化合物得率達(dá)到0.563%;兩種非線性增長模型,即:Sgompertz模型和Logistic模型可以更好地擬合動力學(xué)過程。超聲波輔助提取的工藝參數(shù)及所建立動力學(xué)數(shù)學(xué)模型,均可用于石榴皮中三萜類化合物提取過程的工程放大和優(yōu)化控制。

        石榴皮;三萜類化合物;超聲波;動力學(xué)分析

        石榴(Punica granatum L.)又名安石榴、丹若,其干燥果皮入藥稱為石榴皮,是一種常用中藥材,始載于《雷公炮炙論》,也是《中國藥典》2010版收載品種[1]。石榴皮中生物活性物質(zhì)種類豐富,含量較高的成分除了多酚類成分外[2-4],還有熊果酸、齊墩果酸等三萜類化合物,后者已引起國內(nèi)研究人員的廣泛關(guān)注[5-6]。石榴皮中三萜類化合物,在空氣中易被氧化變質(zhì),傳統(tǒng)的溶劑提取方法,耗時較長、提取效率低,不利于有效成分的浸出。超聲波輔助溶劑法,通過產(chǎn)生高效的空化效應(yīng),使提取過程能夠在短時間內(nèi)完成,從而有效避免了三萜類化合物被氧化而喪失生物活性。在國內(nèi),已有學(xué)者對該方面進(jìn)行研究,如馬雄等[7]采用超聲波輔助溶劑提取法提取石榴皮中熊果酸,并對其最佳工藝通過正交試驗進(jìn)行探究,然而,類似的文獻(xiàn)多限于對工藝條件的優(yōu)化而提高三萜類化合物得率方面的研究,且方法單一,缺乏可靠的理論指導(dǎo),關(guān)于超聲波輔助提取動力學(xué)方面的研究未見報道。因此,本研究以石榴皮為材料,在傳統(tǒng)溶劑提取法基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken試驗設(shè)計,優(yōu)化超聲波強化輔助提取工藝條件,并通過建立提取過程的動力學(xué)模型及評價體系,為工業(yè)化大生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        石榴采自山東嶧城“萬畝石榴園”產(chǎn)區(qū),經(jīng)棗莊學(xué)院李思健副教授鑒定為石榴科石榴(Punica granatum L.),手工取皮經(jīng)低溫干燥后粉碎到要求粒度,備用;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號:110742-201220) 中國食品藥品檢定研究院;甲醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸、無水乙醇、蒸餾水等均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        JA5003B型電子分析天平 上海精科儀器有限公司;TU-1800SPC型紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;HN-CQY型低溫超聲波萃取儀 上海汗諾儀器有限公司;FW135型多功能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定[8-10]

        精密稱取干燥至恒質(zhì)量的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg于25 mL容量瓶中,以甲醇為溶劑溶解并定容,即得0.2 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確量取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL,分別置于25 mL具塞玻璃比色管中,水浴加熱揮盡溶劑,加入0.6 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)和2 mL高氯酸,保持60 ℃反應(yīng)20 min,冰浴冷卻后,加入冰乙酸,充分振搖,于550 nm波長處測定吸光度(A),并以A值為縱坐標(biāo),熊果酸系列質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程為:A=0.034C-0.032 8,R2=0.998 3,熊果酸含量在0~0.011 2 mg/mL范圍內(nèi)與A值之間線性關(guān)系良好。

        1.3.2 樣品處理

        精確稱取干燥后石榴皮粉末5 g,按照規(guī)定的料液比加入設(shè)定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,置于低溫超聲波萃取儀中,設(shè)定超聲功率,提取至設(shè)定的反應(yīng)時間。反應(yīng)結(jié)束后,離心分離所得上清液,回收溶劑,干膏用甲醇溶解并定容至100 mL,作為供試品溶液。精確量取供試品溶液2 mL,按照1.3.1節(jié)方法測定A值,計算樣品中三萜類化合物含量及得率。

        1.3.3 提取工藝優(yōu)化設(shè)計

        單因素試驗中,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35)、超聲功率(100、150、200、250、300、350 W)和超聲時間(15、20、25、30、35、40 min)對石榴皮中三萜類化合物提取效果的影響。并在單因素試驗基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken試驗設(shè)計方法,以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率和超聲時間為自變量,并依次編碼為X1、X2、X3、X4,以石榴皮中三萜類化合物得率(Y)為響應(yīng)值,通過響應(yīng)面分析優(yōu)化超聲波輔助提取條件,試驗因素水平見表1。

        表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table1 Factors and their coded levels used in response surface design

        1.3.4 動力學(xué)模型評價參數(shù)

        采用Af、Bf、根平均方差(root mean square error,RMSE)和R24 個參數(shù)評價數(shù)學(xué)模型的擬合程度[11-14]。Af是精準(zhǔn)因子,表示預(yù)測值與實測值的偏離程度,Af值越小,模型擬合度越好;Bf是偏離因子,Bf>1表示實測值比預(yù)測值高,Bf<1表示實測值比預(yù)測值低,因此Bf值越接近1,模型擬合度越好。決定系數(shù)R2和RMSE表示模型的精確度,R2越接近1,RMSE越小,模型精確度越高。Af、Bf和RMSE計算公式如下:

        式中:n表示試驗中實測值的數(shù)目;obs表示實測值;pred表示預(yù)測值。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計采用Design-Expert 8.0.5統(tǒng)計分析軟件,圖形制作和動力學(xué)模型擬合采用Origin Pro 8.0數(shù)據(jù)處理軟件。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 三萜類化合物提取工藝參數(shù)優(yōu)化

        2.1.1 單因素試驗結(jié)果

        2.1.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對三萜類化合物得率的影響

        固定料液比1∶20、超聲功率250 W、超聲時間30 min,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對三萜類化合物得率的影響,結(jié)果見圖1。

        圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對三萜類化合物得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of triterpenoids

        由圖1可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高,三萜類化合物得率逐漸提高,在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時,三萜類化合物得率達(dá)到最高值。隨后,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高,三萜類化合物得率下降。原因是含水醇為極性溶劑,而三萜類化合物多數(shù)為極性化合物,根據(jù)“相似者相溶”原理,通過調(diào)節(jié)溶劑中乙醇與水的比例來調(diào)整溶劑極性,保證三萜類化合物有最佳溶解性,因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

        2.1.1.2 料液比對三萜類化合物得率的影響

        固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、超聲功率250 W、超聲時間30 min,考察料液比對三萜類化合物得率的影響,結(jié)果見圖2。

        圖2 料液比對三萜類化合物得率的影響Fig.2 Effects of solid/liquid ratio on the extraction yield of triterpenoids

        由圖2可知,料液比對三萜類化合物得率的影響相對較大,隨著溶劑用量的增加,三萜類化合物得率隨之增加,但是,當(dāng)料液比在1∶20后,產(chǎn)物得率隨料液比變化幅度不大,原因是料液比達(dá)到1∶20,在超聲作用下,三萜類化合物基本完成從固相向溶劑相的轉(zhuǎn)移,再提高溶劑量不會對產(chǎn)物得率有太大影響,因此,基于經(jīng)濟(jì)方面考慮,料液比1∶20為宜。

        2.1.1.3 超聲功率對三萜類化合物得率的影響

        固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20、超聲時間30 min,考察超聲功率對三萜類化合物得率的影響,結(jié)果見圖3。

        圖3 超聲功率對三萜類化合物得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on the extraction yield of triterpenoids

        由圖3可知,隨著超聲功率的增大,三萜類化合物得率有隨之增大的趨勢,原因是隨著超聲功率增大,超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械振動作用越強烈,物質(zhì)的擴(kuò)散速率越大,三萜類化合物溶出就越快,但是,當(dāng)超聲功率超過250 W后,三萜類化合物得率隨超聲功率增加變化并不明顯,基于節(jié)能方面考慮,確定超聲功率為250 W。

        2.1.1.4 超聲時間對三萜類化合物得率的影響

        固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20、超聲功率250 W,考察超聲時間對三萜類化合物得率的影響,結(jié)果見圖4。

        圖4 超聲時間對三萜類化合物得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on the extraction yield of triterpenoids

        由圖4可知,超聲時間在10~30 min之間時,三萜類化合物得率不斷提高,30 min時得率達(dá)到最大值,繼續(xù)延長超聲時間,三萜類化合物得率下降,可能是由于部分產(chǎn)物被分解,或者是原料中雜質(zhì)不斷溶入而影響了提取效果,因此,超聲時間初步確定為30 min。

        2.1.2 Box-Behnken試驗設(shè)計及顯著性分析

        根據(jù)Design-Expert 8.0.5統(tǒng)計分析軟件提供的數(shù)學(xué)模型,以三次平行試驗中三萜類化合物得率(Y)的平均值作為響應(yīng)值,響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果見表2。

        對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到石榴皮中三萜類化合物得率(Y)對響應(yīng)變量X1、X2、X3、X4的回歸方程為:

        表2 響應(yīng)面試驗方案與試驗結(jié)果Table2 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental dessiiggnn

        表3 二次回歸方程方差分析結(jié)果Table3 Analysis of variance of regression equation

        表3為二次回歸方程方差分析結(jié)果,回歸模型的負(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.951 1,P<0.000 1,說明模型達(dá)到極顯著水平,失擬項P=0.172 5,影響不顯著,模型決定系數(shù)=0.902 3,表示可以用此數(shù)學(xué)模型解釋90.23%的變異性;變化系數(shù)=3.47%,這個數(shù)值相對較小,說明該回歸模型可信度較高;一般情況下,認(rèn)為精密度值大于4是合理的,本試驗該值達(dá)到13.293。說明該方程擬合良好,可以應(yīng)用上述方程描述各響應(yīng)變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系,以評價各因素對響應(yīng)值影響的顯著性[15]。

        2.1.3 單因素效應(yīng)分析

        將回歸方程中的4個自變量中的3 個固定在0水平,分別得到乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、料液比(X2)、超聲功率(X3)、超聲時間(X4)的單因素模型。

        乙醇體積分?jǐn)?shù):y=0.55+0.001 5X-0.08511

        圖5 響應(yīng)變量水平與三萜類化合物得率的關(guān)系圖Fig.5 Triterpenoids yield as a function of four independent variables at fi ve different levels

        將4 個響應(yīng)變量分別固定在-2、-1、0、1、2的5個水平,得到各響應(yīng)變量的單因素效果圖[16-17]。由圖5可知,4 個響應(yīng)變量均為開口向下的拋物線,且各因素的極值點集中在編碼0附近,在極值點處,三萜類化合物得率最高,如果偏離極值點,會導(dǎo)致產(chǎn)物得率下降。這為工藝優(yōu)化結(jié)果的取值范圍提供了理論參考。

        2.1.4 各因素交互效應(yīng)分析

        應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件繪制兩兩因素之間交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖[18],見圖6。在此重點考察交互效應(yīng)顯著的乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)和超聲功率(X3)、料液比(X2)和超聲功率(X3)、超聲功率(X3)和超聲時間(X4)間的交互效應(yīng)。

        圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots

        由圖6可以看出,3 個響應(yīng)面均為平滑的曲面,且開口向下,說明最大響應(yīng)值就存在于曲面上,且在所設(shè)計的因素水平范圍內(nèi)能夠找到最佳工藝條件。影響因素之間,X1與X3交互作用極其顯著(P<0.01),表現(xiàn)為曲線比較陡峭;X2與X3、X3與X4之間交互作用較顯著(P<0.05)。理論上認(rèn)為,超聲波功率越大,溶劑提取系統(tǒng)越容易獲得較大的聲強,提取效率應(yīng)該越高。但是超聲功率對于三萜類化合物得率的影響并不能一概而論,要充分考慮超聲波與介質(zhì)間的相互作用和提取物質(zhì)本身的性質(zhì)。本試驗中,3種交互效應(yīng)均體現(xiàn)出沿X3軸曲線變化密集,說明X3比X1、X2、X4對于響應(yīng)值的影響大,因此是在提取過程中,超聲功率是4個變量中重點考察的因素。

        2.1.5 最佳工藝條件的確定及驗證

        利用Design-Expert 8.0.5統(tǒng)計分析軟件對所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行工藝參數(shù)最優(yōu)化分析,得到石榴皮超聲波輔助浸提的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)71.2%、料液比1∶20.2、超聲功率318 W、超聲時間36.7 min,三萜類化合物得率的模型預(yù)測值為0.570%。為了檢驗工藝參數(shù)的準(zhǔn)確性,根據(jù)上述試驗條件進(jìn)行3 次平行驗證實驗,測得三萜類化合物平均得率為0.563%,相對誤差約為1.24%,說明應(yīng)用Box-Behnken試驗設(shè)計所得的最佳工藝參數(shù)具有可靠性。

        2.2 三萜類化合物提取過程動力學(xué)分析

        2.2.1 動力學(xué)數(shù)學(xué)模型的建立

        精確稱取干燥后石榴皮粉末5 g共計15 份,固定乙醇體積分?jǐn)?shù)71.2%、料液比1∶20.2,在不同超聲功率條件下(150、200、250、300、350 W)進(jìn)行超聲波輔助提取,反應(yīng)10 min后,每隔5 min取樣0.1 mL,測定提取過程中三萜類化合物質(zhì)量濃度并計算得率(n=3)。

        實驗過程中,每次取走樣液體積0.1 mL測定三萜類化合物質(zhì)量濃度,重復(fù)11 次,這樣將會影響結(jié)果的精密度。于是,通過公式(5)修正提取系統(tǒng)三萜類化合物的質(zhì)量濃度[19-20]:

        式中:Cn為第n次取樣三萜類化合物質(zhì)量濃度修正值/(mg/mL);Ci為第i次取樣三萜類化合物質(zhì)量濃度測定值/(mg/mL);VT為提取液體積數(shù)/mL;n為取樣次數(shù),n=1,2,......11。

        在不同超聲功率提取條件下,石榴皮中三萜類化合物得率隨超聲時間的變化規(guī)律如圖7所示。

        由圖7可以看出,在不同超聲功率條件下,三萜類化合物得率均隨時間的延長而逐漸提高;超聲功率越高,達(dá)到提取平衡所需要的時間越短,說明超聲功率對提取結(jié)果產(chǎn)生了較大的影響。提取過程的前30 min,三萜類化合物得率隨時間變化幅度較大;而在提取時間超過30 min后,產(chǎn)物得率隨時間變化緩慢。

        圖7 三萜類化合物得率與超聲時間的關(guān)系Fig.7 Relationship between triterpenoids yield and ultrasonic time

        采用Origin Pro8.0軟件對圖7中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合[21],并以Af、Bf、RMSE和R24 個參數(shù)評價數(shù)學(xué)模型的擬合程度[11-14]。結(jié)果見表4。

        表4 不同超聲功率條件下動力學(xué)數(shù)學(xué)模型Table4 Kinetic mathematical models under different ultrasonic powers

        由表4可知,Origin Pro8.0軟件中固有的2 種指數(shù)函數(shù)模型(Asymptotic1模型、Expdecay1模型)和2 種非線性增長函數(shù)模型(Logistic模型、Sgompertz模型)均能很好地擬合三萜類化合物提取得率曲線。通過對Af、Bf、RMSE和R24個模型擬合參數(shù)的綜合分析可以得出:Logistic模型和Sgompertz模型的Bf、R2值更接近1,Af、 RMSE值更小,其中,超聲功率在150、250、350 W提取條件下,Logistic模型的4 種模型擬合參數(shù)值達(dá)到最佳,模型達(dá)到最優(yōu)擬合;而超聲功率在200、300 W提取條件下,Sgompertz模型的擬合參數(shù)值達(dá)到最佳,模型達(dá)到最優(yōu)擬合。

        2.2.2 模型預(yù)測結(jié)果的驗證

        為了更好比較不同超聲功率條件下,最優(yōu)模型的預(yù)測值與實測值之間的相關(guān)性,以實測值為橫坐標(biāo),模型預(yù)測值為縱坐標(biāo)求算二者之間的擬合方程,探索線性關(guān)系[12,14],結(jié)果見表5。

        表5 不同超聲功率條件下最優(yōu)模型預(yù)測值與真實值擬合方程Table5 Fitting equations between predicted values from the optimal model and actual values under different ultrasonic powers

        由表5可知,不同功率條件下,擬合方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.997 5,這說明,最優(yōu)模型預(yù)測值與真實值之間呈現(xiàn)良好相關(guān)性。因此,在本實驗中,Logistic模型和Sgompertz模型這2種非線性增長函數(shù)模型,是描述石榴皮中三萜類化合物提取動力學(xué)過程的最佳數(shù)學(xué)模型。

        3 討論與結(jié)論

        國內(nèi)外已有文獻(xiàn)報道超聲波輔助提取紅緣擬層孔菌[22]、神秘果葉[23]、北五味子果實及葉[24]等材料中三萜類化合物的工藝條件,結(jié)果顯示,超聲波輔助提取工藝時間短、效率高。本實驗研究了超聲波輔助提取石榴皮三萜類化合物的工藝條件,產(chǎn)物得率為0.563%,超聲時間為36.7 min,和國內(nèi)同類研究[6,25]相比較,結(jié)果令人滿意。在天然產(chǎn)物提供動力學(xué)模型研究領(lǐng)域,Logistic模型已有相關(guān)報道[21],而Sgompertz模型則鮮有報道。

        超聲波輔助提取石榴皮中三萜類化合物工藝中,影響產(chǎn)物得率的各因素主次順序為:超聲時間>料液比>超聲功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)。最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)71.2%、料液比1∶20.2、超聲功率318 W、超聲時間36.7 min,三萜類化合物平均得率為0.563%。對不同超聲功率條件下三萜類化合物得率隨時間的動力學(xué)變化采用了4 種動力學(xué)模型進(jìn)行擬合,用Af、Bf、RMSE和R24 個模型擬合參數(shù)對擬合結(jié)果進(jìn)行判定。結(jié)果顯示:超聲功率在150、250、350 W條件下,Logistic模型擬合效果最佳;而超聲功率在200、300 W條件下,Sgompertz模型得到最優(yōu)擬合,模型的預(yù)測值與實測值之間的擬合程度很高。

        參考文獻(xiàn):

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        Optimization and Kinetic Analysis of Ultrasonic-Assisted Extraction of Triterpenoids from Pomegranate Rind

        WANG Zhanyi1, ZHENG Dandan1, WANG Jinglong1, JIN Meihua2, ZHANG Lihua1, WANG Yuhai1
        (1. College of Life Science, Zaozhuang University, Zaozhuang 277160, China; 2. College of Pharmacy, Medical University of Tianjin, Tianjin 300070, China)

        This study examined the ultrasonic-assisted extraction conditions of triterpenoids from pomegranate rind. Single factor method and Box-Behnken experimental design were used to optimize the extraction process employing triterpenoids yield as the response and ethanol concentration, solid/liquid ratio, ultrasonic power and extraction time as the independent variables. Using the optimized extraction conditions, the kinetics of the extraction process was studied by establishing four mathematical models, and the applicability of these models was analyzed by four model evaluation parameters including coeffi cient of determination (R2), accuracy factor (Af), bias factor (Bf) and root mean square error (RMSE). Results showed that the optimal extraction conditions for triterpenoids were determined as follows: ethanol concentration, 71.2%; solid/ liquid ratio, 1:20.2; ultrasonic power, 318 W; and ultrasonic time, 36.7 min. Under these conditions, the yield of triterpenoids was 0.563%, and two nonlinear growth models, namely Sgompertz model and Logistic model, could better fi t the kinetics. Both the optimized ultrasound-assisted extraction technique and the kinetic mathematical models can be used for industrial scale-up and optimal control of triterpenoids extraction from pomegranate rind.

        pomegranate rind; triterpenoids; ultrasonic; kinetic analysis

        R284.2

        A

        1002-6630(2015)22-0011-07

        10.7506/spkx1002-6630-201522003

        2015-03-30

        2012年度國家星火計劃項目(2012GA740049);山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2013BL018)

        王占一(1980—),男,講師,碩士,主要從事天然藥物活性成分提取與分離研究。E-mail:zhyiwang@126.com

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