張發(fā)宇，趙冰冰，陳 裕，袁夢媛，汪家權(quán)*

（合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

兩步鹽析聯(lián)合雙水相萃取提取純化藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白

張發(fā)宇，趙冰冰，陳 裕，袁夢媛，汪家權(quán)*

（合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

以巢湖新鮮藍(lán)藻為處理對象，采取凍融破壁的方式獲取藻藍(lán)蛋白的粗提液，采取兩步鹽析聯(lián)合雙水相萃取的方法提取純化藻藍(lán)蛋白。運(yùn)用0.618法選點(diǎn)實(shí)驗(yàn)研究了兩步鹽析中(NH4)2SO4飽和度對提取純化影響，構(gòu)建了聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-(NH4)2SO4的雙水相體系，綜合考慮PEG相對分子質(zhì)量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值和藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度對提取純化藻藍(lán)蛋白的影響。結(jié)果表明：室溫25 ℃條件下，一步鹽析時(shí)(NH4)2SO4的最佳飽和度為21%，二步鹽析時(shí)(NH4)2SO4的最佳飽和度為30%。兩步鹽析后得到的藻藍(lán)蛋白構(gòu)建成PEG-(NH4)2SO4的雙水相體系后，當(dāng)PEG相對分子質(zhì)量1 000、PEG 1 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%時(shí)，藻藍(lán)蛋白的純度可達(dá)3.45。

兩步鹽析；雙水相萃?。惶崛〖兓?；藻藍(lán)蛋白

富營養(yǎng)化是指由于人類的活動(dòng)，水體中營養(yǎng)物質(zhì)增加（一般是氮、磷的化合物），引起浮游植物過量生長和整個(gè)水體生態(tài)平衡的改變，因而造成危害的一種污染現(xiàn)象[1]。其結(jié)果是引起水質(zhì)惡化、溶解氧耗竭、透明度降低、漁業(yè)減產(chǎn)、阻塞航道，對人和動(dòng)物產(chǎn)生毒性等。這種現(xiàn)象在江河湖泊中稱為“水華”，在海洋 則稱為“赤潮”。水華的發(fā)生不僅制約了湖泊水資源的可利用行，而且直接危害人類的健康生存和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展[2]。

湖泊中富營養(yǎng)化主要表現(xiàn)形式為藍(lán)藻爆發(fā)，水華污染嚴(yán)重。目前，對水華藍(lán)藻資源化研究較多是藍(lán)藻產(chǎn)沼氣和用作低端肥料[3]，產(chǎn)品附加值低，經(jīng)濟(jì)效益不高，要實(shí)現(xiàn)新鮮藍(lán)藻的資源化，從中提取高附加值藻藍(lán)蛋白的資源化路線，最為符合目前經(jīng)濟(jì)社會(huì)需求。很多研究表明高純度藻藍(lán)蛋白具有良好的功效，如抗炎性[4]、抗癌性[5]、抗衰老性[6]、抗氧化性[7-8]、免疫熒光性[9-10]等。水華藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白的含量達(dá)5%以上[11]，從水華藍(lán)藻中提取純化純天然的藻藍(lán)蛋白既能達(dá)到消除污染的目的，又可實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益的最大化。

提取純化藻藍(lán)蛋白的研究[12-19]較多，實(shí)驗(yàn)選擇以反復(fù)凍融破壁的方式獲得藻藍(lán)蛋白粗提液，在此基礎(chǔ)上研究鹽析法聯(lián)合雙水相萃取法提取純化藻藍(lán)蛋白的最優(yōu)組合條件。根據(jù)前期破壁藍(lán)藻獲取藻藍(lán)蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[20]，選用了反復(fù)凍融破壁提取藻藍(lán)蛋白粗提液。另外，因?yàn)辂}析法具有應(yīng)用成熟、材料來源廣泛、易于工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)。雙水相萃取不僅條件溫和、容易放大、可連續(xù)操作，還能使目標(biāo)蛋白的純度得到較大提升，現(xiàn)已被廣泛用于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多肽、細(xì)胞器等產(chǎn)品的分離和純化[21-22]。因此選用鹽析法聯(lián)合雙水相萃取法提取純化藻藍(lán)蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮藍(lán)藻藻泥采自巢湖西湖區(qū)水華暴發(fā)表層20 cm水體，含水量約為96.2%，采集日期為2013年8月9日，采樣期間天氣晴朗，室外氣溫37～38 ℃。藍(lán)藻采集后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室放入冰柜內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

(NH4)2SO4、NaOH 廣東西隴化工股份有限公司；NaCl 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硫酸 上海振企化學(xué)試劑有限公司；乙醇 上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV/VΙS-1950型紫外-可見分光光度儀 北京普析通用公司；85-2A型恒溫?cái)嚢杵?江蘇金城國勝儀器廠；KDC-160HR型低溫高速離心機(jī) 安徽中科中佳儀器公司；BC/BD-718DTF型冷柜 天長市天一電器有限公司。

1.3 方法

主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀和神經(jīng)癥狀。雛雞表現(xiàn)明顯的呼吸困難，呼吸時(shí)張口伸頸，氣喘，發(fā)出“呼嚕”聲，咳嗽，口中有粘液，有搖頭和吞咽動(dòng)作，并出現(xiàn)死亡。一周左右大部分病雞出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，少數(shù)雞出現(xiàn)扭頸、歪頭，頭向后仰，共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀，安靜時(shí)恢復(fù)常態(tài)，稍遇刺激，反復(fù)發(fā)作，成年產(chǎn)蛋雞表現(xiàn)輕微，產(chǎn)蛋率下降10%～30%，同時(shí)蛋的品質(zhì)下降。

1.3.1 各指標(biāo)的計(jì)算

藻藍(lán)蛋白在620 nm波長處有特征吸收峰，蛋白在280 nm波長處有最大吸收峰，藻藍(lán)蛋白的純度（P）測量參考Herrera等[23]推薦的公式，藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度（ρ）、得率（Q）參考Soni等[24]的推薦公式，藻藍(lán)蛋白在雙水相中的分配系數(shù)（K）、在上相中的回收率（Y）參見文獻(xiàn)[25]。

藻藍(lán)蛋白純度見公式（1）：

藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度見公式（2）：

藻藍(lán)蛋白得率見公式（3）：

藻藍(lán)蛋白分配系數(shù)見公式（4）：

式（1）～（5）中：A280nm、A620nm、A650nm分別為波長280、620、650 nm處的吸光度；V為藻藍(lán)蛋白體積/mL；m為藻泥質(zhì)量/g；k1為藻藍(lán)蛋白稀釋倍數(shù)；k2為藻泥中藍(lán)藻干物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；Ct、Cb分別為雙水相體系中上下相的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度/（g/L）；R為雙水相中上下相的體積比。

1.3.2 藻藍(lán)蛋白粗提液的制備

取冷凍保存的含水率為9 6.2%的巢湖新鮮水華藍(lán)藻，反復(fù)凍融3次。取解凍后的藍(lán)藻于4 ℃、8 000 r/min離心20 min，上清液過4 層普通紗布，即可得到藻藍(lán)蛋白粗提液。

1.3.3 兩步(NH4)2SO4鹽析

根據(jù)0.618法的原理，在10%～60%的(NH4)2SO4飽和度范圍內(nèi)，進(jìn)行一步鹽析：分別向1.3.2節(jié)中所取得藻藍(lán)蛋白粗提液中緩慢加入(NH4)2SO4，以防止溶液局部質(zhì)量濃度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。(NH4)2SO4的飽和度調(diào)節(jié)至17%、19%、20%、21%、22%、24%、29%、41%共8 組。溶解后4 ℃、8 000 r/min離心20 min，傾倒上清液，測定藻藍(lán)蛋白純度和得率。根據(jù)0.618法的原理，在(NH4)2SO4飽和度為21%～70%范圍內(nèi)，進(jìn)行二步鹽析：將1.3.2節(jié)取得藻藍(lán)蛋白粗提液經(jīng)一次鹽析，即(NH4)2SO4飽和度調(diào)至21%，離心，取上清液備用。分別將備用液中(NH4)2SO4的飽和度追加至28.16%、29.28%、29.8%、30.4%、30.92%、32.56%、35.32%、39.72%、51.28%共9 組。溶解后4 ℃、8 000 r/min離心10 min，沉淀用磷酸緩沖溶液（0.002 5 mol/L）溶解后測藻藍(lán)蛋白純度和得率。

1.3.4 光譜圖繪制

藻藍(lán)蛋白粗提液經(jīng)250～700 nm波長范圍掃描，發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白在620 nm波長處有特征吸收峰，在280 nm波長處有最大吸收峰，經(jīng)計(jì)算藻藍(lán)蛋白粗提液純度0.426，光譜圖如圖1所示。

圖1 藻藍(lán)蛋白紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-visible absorption spectrum of phycocyanin

1.3.5 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

兩步鹽析實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，獲得了純度為1.969的藻藍(lán)蛋白溶液?？紤]該溶液中有部分(NH4)2SO4剩余，因此直接建立起聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-(NH4)2SO4雙水相體系，綜合考慮PEG相對分子質(zhì)量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值和藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度的影響，以藻藍(lán)蛋白純度為衡量指標(biāo)，了解雙水相分層的情況，以此探索雙水相體系的效果，按照L16（54）建立正交試驗(yàn)，影響因素及水平如表1所示。

表1 PEG-((NNHH4)2SSOO4正交試驗(yàn)影響因素及水平Table1 Factors and levels used in orthogonal array experiments on aqueous PEG--((NNHH4)2SSOO4two-phase systteemm

2 結(jié)果與分析

2.1 一步鹽析單因素試驗(yàn)結(jié)果

在室溫25 ℃條件下，在10%～60%的(NH4)2SO4飽和度范圍內(nèi)，依據(jù)1.3.3節(jié)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與一些鹽析法較粗放選取單因素試驗(yàn)點(diǎn)相比[26]，最終根據(jù)0.618法的原理精細(xì)選取了(NH4)2SO4飽和度為17%～41%，即圖2中1～8實(shí)驗(yàn)序號(hào)點(diǎn)，測定上清液中藻藍(lán)蛋白純度和得率。

圖2 一步鹽析((NNHH4)2SSOO4飽和度對藻藍(lán)蛋白純度和得率的影響Fig.2 Effect of different degrees of ammonium sulfate saturation on phycocyanin purity and yield in the fi rst salting-out prec ipitation

圖2 為一步鹽析時(shí)，藻藍(lán)蛋白純度和得率在(NH4)2SO4飽和度為10%～60%之間的變化情況。當(dāng)(NH4)2SO4飽和度在10%～21%時(shí)，上清液中藻藍(lán)蛋白純度和得率均呈上升趨勢，在(NH4)2SO4飽和度為21%即實(shí)驗(yàn)序號(hào)為第4點(diǎn)時(shí)，藻藍(lán)蛋白純度和得率分別達(dá)到和接近最大值，分別為0.519和3.47%，當(dāng)(NH4)2SO4飽和度大于24%后純度明顯下降，得率逐步下降。因此，一步鹽析時(shí)(NH4)2SO4的最佳飽和度為21%。

2.2 二步鹽析單因素試驗(yàn)結(jié)果

在室溫25 ℃條件下，依據(jù)1.3.3節(jié)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，精細(xì)追加(NH4)2SO4的飽和度至28.16%～51.28%共9個(gè)實(shí)驗(yàn)序號(hào)點(diǎn)，得到的藻藍(lán)蛋白沉淀經(jīng)溶解后測藻藍(lán)蛋白純度和得率。

圖3 二步鹽析((NNHH4)2SSOO4飽和度對藻藍(lán)蛋白純度和得率的影響Fig.3 Effect of different degrees of ammonium sulfate saturation on phycocyanin purity and yield in the second salting-out precipitation

圖3 表明，當(dāng)(NH4)2SO4飽和度為21%～29.8%時(shí)，沉淀中藻藍(lán)蛋白的純度和得率均呈上升趨勢，在(NH4)2SO4飽和度為29.8%時(shí)，沉淀中藻藍(lán)蛋白的純度和得率分別達(dá)到和接近最大值，為1.969和2.95%。當(dāng)(NH4)2SO4飽和度大于29.8%時(shí)純度開始下降。因此，二步鹽析可選取(NH4)2SO4飽和度為30%即實(shí)驗(yàn)序號(hào)為第3點(diǎn)時(shí)，即可得到最優(yōu)提取純化效果。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 PEC-(NH4)2SOSO4雙水相正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of orthogonal array experiments of aqueous PEGG--((NNHH4)2SSOO4two-phase system

由表2可以看出，各因素對純度的影響大小為PEG相對分子質(zhì)量＞PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度＞pH值＞(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)。主要影響因素是PEG相對分子質(zhì)量，其他4 個(gè)因素影響并不明顯。PEG-(NH4)2SO4雙水相最優(yōu)萃取條件為PEG相對分子質(zhì)量1 000、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度2 g/L、pH 6、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，上相中得到純度為2.619的藻藍(lán)蛋白液。另外發(fā)現(xiàn)當(dāng)選用PEG 1 000-(NH4)2SO4構(gòu)建雙水相體系時(shí)，上相藻藍(lán)蛋白的純度基本上均有上升，分配系數(shù)較大，并且藻藍(lán)蛋白的回收率較大，能起到較好的提取純化藻藍(lán)蛋白的作用。

2.4 PEG 1 000-(NH4)2SO4雙水相萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由2.3節(jié)正交試驗(yàn)可知，構(gòu)建PEG 1 000-(NH4)2SO4雙水相體系對提取純化藻藍(lán)蛋白有很好的效果，為此進(jìn)一步進(jìn)行PEG 1 000-(NH4)2SO4單因素試驗(yàn)，了解PEG 1 000與(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對純化后藻藍(lán)蛋白純度的影響。

因此，選取新一批巢湖藍(lán)藻藻泥，進(jìn)行凍融破壁處理，按照一步鹽析和兩步鹽析方法，得到純度為2.653的藻藍(lán)蛋白液。構(gòu)建PEG 1 000-(NH4)2SO4雙水相體系，選取(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%不變，進(jìn)行PEG 1 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化對萃取藻藍(lán)蛋白純度的影響實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、PEG 1 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%時(shí)，一次雙水相萃取后，藻藍(lán)蛋白純度達(dá)3.38，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 PEG 1 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化對藻藍(lán)蛋白純度的影響Fig.4 Effect of different PEG 1 000 mass fractions on phycocyanin purity

另外，選定PEG 1 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%不變，進(jìn)行(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對萃取純度的影響實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%、PEG 1 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%時(shí)，一次雙水相萃取后，藻藍(lán)蛋白的純度達(dá)3.45，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 ((NNHH4)2SSOO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化對藻藍(lán)蛋白純度的影響Fig.5 Effect of different ammonium sulfate mass fractions on phycocyanin purity

3 結(jié) 論

在兩步鹽析過程中，運(yùn)用0.618法選取實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，得出了兩步鹽析過程中，最佳(NH4)2SO4飽和度分別為21%和30%。運(yùn)用正交試驗(yàn)法，合理初選了PEG-(NH4)2SO4的雙水相體系，該體系對提取純化藻藍(lán)蛋白有較大作用。得出結(jié)論為：藻藍(lán)蛋白粗提液經(jīng)最佳(NH4)2SO4飽和度條件下的兩步鹽析后純度可達(dá)2.653。后構(gòu)建PEG 1 000-(NH4)2SO4雙水相體系，當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%、PEG 1 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%時(shí)，上相中藻藍(lán)蛋白的純度可達(dá)3.45。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)了不同批次藍(lán)藻藻泥，獲取的藻藍(lán)蛋白含量不同，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有所差別，建立藻泥含固或量含藻藍(lán)蛋白量與鹽析及雙水相參數(shù)關(guān)系就變得十分重要，并且雙水相中上相的PEG去除或回收也是當(dāng)前亟需解決的問題。在巢湖藍(lán)藻水華現(xiàn)象日益加劇的情況下，藍(lán)藻資源化應(yīng)用研究，尤其是藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白高附加值資源化的研究緊迫并富有意義，它本身就符合循環(huán)經(jīng)濟(jì)的理念。在提取純化工藝上，兩步鹽析聯(lián)合雙水相萃取能起到較好的效果，為后期實(shí)驗(yàn)的開展以及生產(chǎn)線的建設(shè)提供了參考。

[1] 劉建康, 高級水生生物學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1999: 326-330.

[2] 孔繁翔, 宋立榮. 藍(lán)藻水華形成過程及其環(huán)境特征研究[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2011: 2-50.

[3] 韓士群, 嚴(yán)少華, 王震宇, 等. 太湖藍(lán)藻無害化處理資源化利用[J].自然資源學(xué)報(bào), 2009, 24(3): 431-437.

[4] ROMAY C, GONZALEZ R, LEDON N, et al. C-phycocyanin: a biliprotein with antioxidant, anti-inflammatory and neuroprotective effects[J]. Current Protein and Peptide Science, 2003, 4(3): 207-216.

[5] 王勇, 錢峰, 錢凱先. 藻藍(lán)蛋白抗癌活性研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 35(6): 672-675.

[6] 趙艷景, 湯云成. 條斑紫菜藻藍(lán)蛋白的分離純化及其抗衰老作用研究[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(17): 94-97.

[7] 汪興平, 謝筆均, 潘思軼, 等. 葛仙米藻藍(lán)蛋白抗氧化作用研究[J].食品科學(xué), 2007, 28(12): 458-461.

[8] 楊立紅, 王曉潔, 鐘旭升, 等. 魚腥藻藻藍(lán)蛋白的抗氧化作用[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(12): 208-212.

[9] 李濟(jì)平. 藻藍(lán)蛋白對免疫系統(tǒng)的活性的研究[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2000, 16(7): 647-648.

[10] 吳萍. 藻膽蛋白與熒光免疫分析[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展, 2000, 31(1): 82-84.

[11] 范良民. 滇池藍(lán)藻成分分析及利用途徑探討[J]. 云南環(huán)境科學(xué), 1999, 18(2): 46-47.

[12] 胡一兵, 胡鴻鈞, 李夜光, 等. 從一種富含藻膽蛋白的螺旋藻中大量提取和純化藻藍(lán)蛋白的研究[J]. 武漢植物學(xué)研究, 2002, 20(4): 299-302.

[13] 溫少虹, 趙呈龍, 張莉萍. 紫球藻B-藻紅蛋白的分離純化[J]. 中國海洋藥物, 2002, 82(3): 33-35.

[14] CAMREN S S, TERESA P N, ROXANA O R, et al. Extraction and purifieation of phycocyanin from Calothrix sp.[J]. Process Biochemistry, 2004, 39(12): 2047-2052.

[15] 劉楊, 王雪青, 龐廣昌, 等. 鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白的富集分離及其穩(wěn)定性研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(7): 39-42.

[16] 郭靜, 王峰, 崔正剛, 等. 膨脹床-固定床層析偶聯(lián)方式分離純化藻藍(lán)蛋白[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(10): 107-111. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201310023.

[17] 吳蕾, 龐廣昌, 陳慶森. 螺旋藻藻藍(lán)蛋白的規(guī)模化提取和色譜純化技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(4): 461-463.

[18] KALEDONA M, MAGDALENA T, ALEKSEY T, et al. Improved procedure for separation and purification of Arihronema africanum phycobili proteins[J]. Biotechnology Letters, 2007, 29(4): 647-651.

[19] JORGE B, MARCO R. Simplified two-stage method to B-phycoerythrin recovery from Porphyridium cruentumn[J]. Joumal of Chromatography B, 2006, 844(1): 39-44.

[20] 陳裕, 張發(fā)宇, 趙冰冰, 等. 凍融超聲波聯(lián)合破壁法提取巢湖藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白的研究[J]. 低碳世界, 2015, 6(9): 17-18.

[21] 姜彬, 馮志彪, 陳一. PEG/鹽雙水相體系萃取小麥酯酶的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(9): 200-202.

[22] 岳岑, 馮維希, 黃文, 等. 雙水相萃取法提取條斑紫菜R-藻紅蛋白工藝[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(16): 41-44.

[23] HERRERA A, BOUSSΙBA S, NAPOLENONE V, et al. Recovery of phycocyanin from the cyanobacterium Spirulina maxima[J]. Journal of Applied Phycology, 1989, 1(1): 325-331.

[24] SONΙ B, KALAVADΙA B, TRΙVEDΙ U, et al. Extraction, purification and characterization of phycocyanin form Oscillatoria quadripunctulata: isolate form the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, Ιndia[J]. Process Biochemistry, 2006, 41(9): 2017-2023.

[25] 丙瀟瀟. 藻膽蛋白的雙水相綠色提取技術(shù)研究[D]. 哈爾濱: 哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2009.

[26] 韓士群, 李輝東, 嚴(yán)少華, 等. 太湖藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白的提取及純化[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 28(4): 777-782.

Extraction and Purifi cation of Phycocyanin by the Combined Use of Two-Step Salt Precipitation and Aqueous Two-Phase Extraction from Blue Algae

ZHANG Fayu, ZHAO Bingbing, CHEN Yu, YUAN Mengyuan, WANG Jiaquan*
(School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The crude extracts of phycocyanin from fres h blue algal were obtained by freeze-thaw method. The purifi cation of phycocyanin was performed by the combined use of two-step salting-out precipitation and aqueous two-phase extraction. The effect of different saturation degrees of (NH4)2SO4in two-step salt precipitation on purifi cation effi ciency was investigated using the 0.618 method, and the aqueous two-phase system of polyethylene glycol (PEG)-(NH4)2SO4was established after comprehensively considering the effect of PEG molecular weight, PEG mass fraction, (NH4)2SO4mass fraction, pH and phycocyanin mass concentration on purifi cation effi ciency. The results showed that the optimum (NH4)2SO4saturation was 21% in the fi rst step and 30% in the second step salt precipitation at 25 ℃. Using the aqueous two-phase system containing 10% PEG 1 000 and 25% (NH4)2SO4, the purity of purifi ed phycocyanin was 3.45.

two-step salting-out precipitation; aqueous two-phase extraction; extraction and purifi cation; phycocyanin

TQ464.7

A

1002-6630（2015）22-0006-05

10.7506/spkx1002-6630-201522002

2015-03-15

“十二五”國家科技重大專項(xiàng)（2012ZX07103-004）

張發(fā)宇（1983—），男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)樗幚砑夹g(shù)。E-mail：13655551436@139.com

*通信作者：汪家權(quán)（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗幚砑夹g(shù)。E-mail：jiaquan.wang@163.com