令狐青青，張 雪，童曉倩，王秋萍，羅紅宇，宋 茹

（浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022）

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）發(fā)酵魷魚碎肉的工藝優(yōu)化

令狐青青，張 雪，童曉倩，王秋萍，羅紅宇，宋 茹*

（浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022）

為進(jìn)一步提高魷魚碎肉的利用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)以魷魚碎肉作為納豆芽孢桿菌發(fā)酵基質(zhì)，研究料液比、葡萄糖添加量、發(fā)酵pH值、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對魷魚碎肉發(fā)酵效果的影響。在以單因素試驗(yàn)確定發(fā)酵時(shí)間72 h和發(fā)酵溫度37 ℃的條件后，再對料液比、發(fā)酵pH值和加糖量進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)分析，以發(fā)酵液的氨基態(tài)氮含量為響應(yīng)值，得到納豆芽孢桿菌發(fā)酵魷魚碎肉最佳條件為：料液比1∶1.2（m/V）、發(fā)酵pH 8.8和加糖量3.13%。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，魷魚碎肉發(fā)酵液的氨基態(tài)氮實(shí)際含量達(dá)到2.457 mg/mL。氨基酸分析結(jié)果顯示魷魚碎肉發(fā)酵液富含具有鮮味和甜味特征的谷氨酸（84.141 mg/g）、天冬氨酸（49.480 mg/g）和甘氨酸（49.425 mg/g），達(dá)到氨基酸總量的39.05%。必需氨基酸總量為149.320 mg/g，占氨基酸總量的31.86%。Sephadex G25凝膠過濾層析顯示魷魚碎肉納豆芽孢桿菌發(fā)酵液由多肽、小肽及游離氨基酸組成。

魷魚碎肉；納豆芽孢桿菌；發(fā)酵；響應(yīng)面法；氨基酸組成；相對分子質(zhì)量分布

發(fā)酵在人類文明史上有著悠久的應(yīng)用歷史，食物通過微生物的發(fā)酵作用，不僅能夠延長保質(zhì)期，而且發(fā)酵作用還可以提高食物的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值[1-3]。納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）屬細(xì)菌科，芽孢桿菌屬，是制備發(fā)酵食品常用的一種有益菌，最早分離自傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品--納豆[4]。1987年Sumi等[5]報(bào)道從納豆中提取出對人體無任何毒副作用的溶血栓物質(zhì)--納豆激酶（nattokinase，NK），積極地推動(dòng)了國內(nèi)外對納豆芽孢桿菌及其發(fā)酵產(chǎn)物的研究熱潮。

納豆芽孢桿菌除了用于發(fā)酵豆制品外，還可用于一些藥用動(dòng)植物的發(fā)酵，如海參、金針菇等經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后具有溶栓作用[6-7]。近幾年，在大力倡導(dǎo)食物原料綜合加工利用、提高原料“零浪費(fèi)”背景下，一些食品加工副產(chǎn)物，如：豆粕[8-10]、啤酒糟[11]、米糠[12]等也被用作納豆芽孢桿菌發(fā)酵基質(zhì)，有效地拓寬了納豆芽孢桿菌的應(yīng)用范圍。納豆芽孢桿菌能夠分泌多種蛋白酶[4,13]，這些蛋白酶能將發(fā)酵基質(zhì)中蛋白質(zhì)分解為易被人體吸收利用的寡肽和氨基酸，據(jù)報(bào)道納豆芽孢桿菌發(fā)酵制品多具有抗氧化[12,14-16]、抑菌[17-18]、抗癌[19]等生理活性。

魷魚碎肉是魷魚加工過程中產(chǎn)生的邊角料，這些碎肉蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)豐富，采用添加商業(yè)蛋白酶進(jìn)行水解的方式可以制備功能型魷魚蛋白酶解液[20-22]，但是商業(yè)蛋白酶成本較高。本實(shí)驗(yàn)以魷魚碎肉為發(fā)酵基質(zhì)，結(jié)合納豆芽孢桿菌發(fā)酵技術(shù)以期提高碎肉蛋白的利用價(jià)值，在研究發(fā)酵影響因素基礎(chǔ)上對發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，分析發(fā)酵液的氨基酸組成和相對分子質(zhì)量分布，旨在為魷魚碎肉后續(xù)的新型應(yīng)用以及納豆芽孢桿菌發(fā)酵水產(chǎn)動(dòng)物蛋白研究提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魷魚碎肉，由舟山富丹旅游食品有限公司提供，－20 ℃凍藏。

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto） 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；蛋白胨、瓊脂粉 杭州天和微生物試劑有限公司；酵母浸膏 中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-270型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波東北儀器有限公司；HZQ-B全溫培養(yǎng)搖床 金壇市華城開元實(shí)驗(yàn)儀器廠；LD2X-40BI型立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；722型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；L-8900型氨基酸分析儀 日本東京日立公司；HL-2S型恒流泵、BS-160A自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆芽孢桿菌凍干菌粉復(fù)活

將納豆芽孢桿菌凍干管在無菌條件下開管，用無菌吸管吸取0.5 mL左右LB液體培養(yǎng)基（酵母浸膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 7.0）溶解凍干菌粉，將溶解后菌懸液轉(zhuǎn)移至盛有5 mL的LB液體培養(yǎng)基試管中，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，然后再用LB液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接2～3 代恢復(fù)菌種活力，最后將菌種轉(zhuǎn)接到LB固體斜面培養(yǎng)基質(zhì)中，4 ℃條件下冷藏保存。

1.3.2 魷魚碎肉發(fā)酵培養(yǎng)基制備

將魷魚碎肉解凍，清洗干凈，加入一定量水后在打漿機(jī)中打漿，調(diào)節(jié)漿液pH值，按照魷魚碎肉質(zhì)量加入一定量葡萄糖，然后在121 ℃滅菌15 min，得魷魚碎肉發(fā)酵培養(yǎng)基，備用。

1.3.3 單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝

在發(fā)酵工業(yè)中常用甲醛滴定法測定發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源及利用情況，同時(shí)甲醛滴定法也反映出蛋白質(zhì)水解程度[23]。本實(shí)驗(yàn)在250 mL錐形瓶中固定魷魚碎肉發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為50 g，將1.3.1節(jié)中斜面保藏的納豆芽孢桿菌用LB液體培養(yǎng)基活化至菌懸液濃度約為106個(gè)/mL，然后根據(jù)魷魚碎肉發(fā)酵培養(yǎng)基中碎肉質(zhì)量以2%比例接入相應(yīng)體積的納豆芽孢桿菌菌懸液。以發(fā)酵液的蛋白質(zhì)含量和氨基態(tài)氮含量為指標(biāo)，分別研究魷魚碎肉發(fā)酵培養(yǎng)基中魷魚碎肉質(zhì)量與水體積比（料液比，m/V）（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）、發(fā)酵時(shí)間（24、48、72、96 h）、發(fā)酵初始pH值（6.0、7.0、8.0、9.0）、葡萄糖添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）和發(fā)酵溫度（27、32、37、42 ℃）對魷魚碎肉發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵效果影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝

在發(fā)酵單因素研究基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以發(fā)酵液的氨基態(tài)氮含量為響應(yīng)值，采用Design Expert（v ersion 7.1.4, USA）軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Quadratic模型擬合。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)法[24]測定。做法如下：取稀釋適當(dāng)倍數(shù)的發(fā)酵液1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑（自行配制），振蕩混合，室溫下放置5 min，測定595 nm波長處的吸光度（A），其中蒸餾水代替樣品在同樣反應(yīng)條件下為調(diào)零管，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.6 發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量測定

采用甲醛電位滴定法[23]測定。

1.3.7 氨基酸組成分析

取魷魚碎肉發(fā)酵液凍干品（紅褐色，黏稠狀）50 mg，加入15 mL 6 mol/L的HCl溶解，在110 ℃條件下氮?dú)獗Ｗo(hù)水解22 h，冷卻后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容。取200 μL用55 ℃氮?dú)獯蹈桑尤? mL蒸餾水再烘干，反復(fù)3 次，再用1 mL的0.02 mol/L HCl溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后取濾液20 μL上氨基酸分析儀分析。

1.3.8 發(fā)酵液的相對分子質(zhì)量分布

采用凝膠過濾法對魷魚碎肉發(fā)酵液的相對分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，具體洗脫條件為：發(fā)酵液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取1.0 mL濾液上Sephadex G25分離柱（1.6 cm×56 cm），去離子水洗脫，流速為1.0 mL/min，每3 min收集一管，逐管檢測280 nm波長處的光密度值，以洗脫體積（mL）為橫坐標(biāo)，OD280 nm值為縱坐標(biāo)，采用Origin Pro 8.5繪圖軟件繪制魷魚碎肉發(fā)酵液的相對分子質(zhì)量分布圖。以牛血清白蛋白（Mr68 000）、抑肽酶（Mr6 512）、VB12（Mr1 355）和氧化型谷胱甘肽（Mr613）為相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在相同條件下洗脫，判定魷魚碎肉發(fā)酵液的相對分子質(zhì)量分布范圍。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 納豆芽孢桿菌發(fā)酵魷魚碎肉的單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Infl uence of fermentation conditions on protein and amino nitrogen contents

由圖1a可知，當(dāng)料液比為1∶3（m/V）時(shí)，魷魚碎肉發(fā)酵液的蛋白質(zhì)含量最低，而氨基態(tài)氮含量則保持在較高水平。納豆芽孢桿菌以魷魚碎肉為營養(yǎng)物質(zhì)，通過自身分泌蛋白酶將碎肉中的蛋白質(zhì)水解為多肽、小肽和氨基酸，使得發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量增加。當(dāng)料液比為1∶4時(shí)，發(fā)酵液的氨基態(tài)氮含量降低明顯，可能與菌體直接吸收利用小分子肽和游離氨基酸并作為營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。而當(dāng)料液比加大到1∶5時(shí)，發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量與料液比1∶4時(shí)相比無明顯變化，說明在料液比1∶4～1∶5范圍發(fā)酵液的氨基態(tài)氮物質(zhì)產(chǎn)生量與被菌體利用量保持平衡。

當(dāng)料液比一定時(shí)，發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量和氨基態(tài)氮含量相互影響更為明顯，如圖1b所示，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在24～72 h時(shí)，發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而急劇地降低，而氨基態(tài)氮含量則是大幅度地增加。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于72 h時(shí)，納豆芽孢桿菌分泌的蛋白酶減少，而且菌體也逐漸進(jìn)入衰亡期，對營養(yǎng)物質(zhì)需求減少，所以發(fā)酵液中蛋白質(zhì)和氨基態(tài)氮含量變化平緩。

由圖1c可知，當(dāng)魷魚碎肉發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.0～8.0時(shí)，發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量呈增加趨勢。當(dāng)發(fā)酵pH值為8.0時(shí)，發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量達(dá)到最高值，而當(dāng)pH值為9.0時(shí)，雖然發(fā)酵液的蛋白質(zhì)含量與pH 8.0時(shí)的蛋白質(zhì)含量相比無明顯變化，但是氨基態(tài)氮含量則明顯降低，可能與pH值過高不利于納豆芽孢桿菌分泌蛋白酶有關(guān)。而且菌體又會(huì)優(yōu)先吸收發(fā)酵液中小肽和氨基酸小分子物質(zhì)作為氮素營養(yǎng)，結(jié)果加快了發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量的降低。潘進(jìn)權(quán)[25]曾報(bào)道一株高產(chǎn)蛋白酶的納豆芽孢桿菌在優(yōu)化的培養(yǎng)基上生長繁殖，當(dāng)發(fā)酵起始培養(yǎng)基pH值在8.0～8.5時(shí)有利于該菌種發(fā)酵產(chǎn)酶。所以，圖1c中pH 8.0時(shí)魷魚碎肉發(fā)酵液的氨基態(tài)氮含量較高，可能與該pH值條件下納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶量大或酶活力高有關(guān)。

在蛋白發(fā)酵基質(zhì)中加入適當(dāng)外源糖可以提供菌體生長所需碳源，能加快菌體的生長繁殖速率，促進(jìn)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[26]，而發(fā)酵液中氨基酸及肽類物質(zhì)的積累實(shí)際上是菌體吸收利用和代謝形成這些產(chǎn)物相互平衡的結(jié)果。圖1d結(jié)果顯示，當(dāng)葡萄糖添加量從0.5%增加到1.5%時(shí)，發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量幾乎保持不變，但是氨基態(tài)氮含量急劇降低，應(yīng)與菌體快速生長繁殖需要大量氮素營養(yǎng)且發(fā)酵液中小分子肽及氨基酸類被優(yōu)先吸收作為氮素營養(yǎng)有關(guān)。當(dāng)葡萄糖添加量在1.5%～3.0%時(shí)，發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量變化平緩，說明發(fā)酵液中氨基態(tài)氮類物質(zhì)處于生成和被菌體利用的動(dòng)態(tài)平衡中。但是當(dāng)葡萄糖添加量為3.5%時(shí)，發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量急劇地增加，可能與葡萄糖添加量高導(dǎo)致發(fā)酵液滲透壓變大，納豆芽孢桿菌的生長繁殖速率變慢，結(jié)果氨基態(tài)氮物質(zhì)被菌體吸收利用速率降低，從而造成發(fā)酵液中氨基態(tài)氮類物質(zhì)的大量積累。

由圖1e可知，在發(fā)酵溫度為37℃時(shí)，魷魚碎肉發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量最低，而氨基態(tài)氮含量則保持在較高水平，說明該溫度下納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶活性高，有效地促進(jìn)了魷魚碎肉蛋白水解為小肽和游離氨基酸，與文獻(xiàn)報(bào)道的納豆芽孢桿菌適宜產(chǎn)酶及發(fā)酵溫度35～38 ℃具有一致性[25,27]。

2.2 響應(yīng)面分析優(yōu)化發(fā)酵條件

在固定發(fā)酵時(shí)間72 h和發(fā)酵溫度37 ℃條件下，選擇料液比、發(fā)酵pH值和加糖量進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)分析，因?yàn)榘被鶓B(tài)氮含量有助于反映蛋白質(zhì)的水解程度以及菌體吸收利用發(fā)酵液中小分子肽和游離氨基酸情況，所以選取氨基態(tài)氮含量為響應(yīng)值，對納豆芽孢桿菌發(fā)酵魷魚碎肉條件進(jìn)行優(yōu)化。在綜合考慮發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量變化規(guī)律（單因素試驗(yàn)結(jié)果）基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)料液比、發(fā)酵pH值和加糖量的因素水平及編碼值，具體Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Box-Behnken design with experimental values of amino nitrogen content

對表1結(jié)果進(jìn)行Quadratic擬合，確定氨基態(tài)氮含量（Y）與料液比（X1）、發(fā)酵pH值（X2）和加糖量（X3）回歸方程為：Y=8.064 34－0.873 53X1－1.163 94X2－0.195 37X3+0.044 33X1X2－0.040 44X1X3+0.090 22X2X3+ 0.045 58X12+0.056 08X22－0.069 96X32。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) of response surface quadratic model

對表1結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。模型P值為0.008 8（P＜0.05），具有顯著性，失擬項(xiàng)P值為0.114 8不顯著（P＞0.05），說明該模型能夠預(yù)測實(shí)際結(jié)果。一次項(xiàng)X1和平方項(xiàng)X32對魷魚碎肉發(fā)酵效果有顯著性影響（P＜0.05），即：在發(fā)酵過程中要嚴(yán)格控制料液比和加糖量。此外，由表2還能夠看出，X2X3交互作用P= 0.051 8，略高于0.05，表明發(fā)酵pH值和加糖量對發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量具有一定的交互作用。在固定發(fā)酵時(shí)間72 h和發(fā)酵溫度37 ℃條件下，經(jīng)擬合得出納豆芽孢桿菌發(fā)酵魷魚碎肉最佳條件為：料液比1∶1.2、發(fā)酵pH 8.8、加糖量3.13%，該條件下發(fā)酵液的氨基態(tài)氮理論含量為2.687 mg/mL。在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行3 次平行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測定魷魚碎肉發(fā)酵液的氨基態(tài)氮實(shí)際含量平均值為2.457 mg/mL，與模型預(yù)測理論值無顯著性差異（P＞0.05），所以響應(yīng)面法確定的魷魚碎肉蛋白發(fā)酵條件比較穩(wěn)定可靠。

2.3 氨基酸組成分析

表3 魷魚碎肉發(fā)酵液的氨基酸組成分析Table 3 Amino acid composition of fermented squid meat

由表3可知，魷魚碎肉發(fā)酵液中具有鮮味作用的谷氨酸含量為84.141 mg/g，占測定氨基酸總量的17.95%。另外兩種與鮮味和甜味有關(guān)的天冬氨酸（49.480 mg/g）和甘氨酸含量（49.425 mg/g）分別占測定氨基酸總量的10.56%和10.54%。此外，該發(fā)酵液中的蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸這7 種必需氨基酸總量為149.320 mg/g，占測定氨基酸總量的31.86%。因此，魷魚碎肉經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后得到的發(fā)酵液不僅呈味氨基酸含量豐富，而且必需氨基酸含量較高，有進(jìn)一步開發(fā)為功能型風(fēng)味料的應(yīng)用前景。

2.4 發(fā)酵液的相對分子質(zhì)量分布

圖2 魷魚碎肉發(fā)酵液的Sephadex G25凝膠過濾色譜圖Fig.2 Chromatogram profi le of fermented squid meat isolated by Sephadex G25 gel

魷魚碎肉經(jīng)納豆芽孢桿菌在最優(yōu)發(fā)酵條件下發(fā)酵，所得發(fā)酵液的凝膠過濾色譜圖如圖2所示，魷魚碎肉發(fā)酵液在280 nm波長處有特征吸收峰，且發(fā)酵液的茚三酮反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)均呈陽性，說明該發(fā)酵液含有肽類和游離氨基酸。魷魚碎肉發(fā)酵液經(jīng)Sephadex G25分離得到6 個(gè)分離峰，通過與相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的凝膠過濾圖譜比較可知：魷魚碎肉發(fā)酵液中峰1組分應(yīng)屬于Mr介于1 500～6 000的多肽類，而其余5 個(gè)分離組分（峰2～峰6）應(yīng)與小肽（Mr＜1 500）和游離氨基酸有關(guān)。魷魚碎肉納豆芽孢桿菌發(fā)酵液的肽譜解析有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用納豆芽孢桿菌發(fā)酵法發(fā)酵魷魚碎肉，以期提高其利用價(jià)值，通過單因素試驗(yàn)確定發(fā)酵時(shí)間72 h和發(fā)酵溫度37 ℃條件下，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出納豆芽孢桿菌發(fā)酵魷魚碎肉的最佳發(fā)酵條件為：魷魚碎肉發(fā)酵培養(yǎng)基料液比為1∶1.2、發(fā)酵pH 8.8、加糖量3.13%。在此條件下，魷魚碎肉發(fā)酵液的氨基態(tài)氮實(shí)際含量達(dá)到2.457 mg/mL，該發(fā)酵液不僅鮮味和甜味風(fēng)味氨基酸含量豐富，而且必需氨基酸含量高，發(fā)酵液中含有多肽、小肽及游離氨基酸。納豆芽孢桿菌一般主要用于豆類食品的發(fā)酵，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明魷魚碎肉可以作為納豆芽孢桿菌發(fā)酵基質(zhì)，為納豆芽孢桿菌在水生生物蛋白高值化應(yīng)用方面提供了技術(shù)依據(jù)。

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Optimization of Fermentation Conditions of Minced Squid Meat by Bacillus natto

LINGHU Qingqing, ZHANG Xue, TONG Xiaoqian, WANG Qiuping, LUO Hongyu, SONG Ru*
(Zhejiang Provincial Key Laboratory of Health Risk Factors for Seafood, College of Food Science and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

In the present study, minced squid meat was used as the fermentation substrate for Bacillus natto to improve the application value of squid minced meat. The effects of liquid-solid ratio (1:2-1:5), glucose concentration (0.5%-3.5%), initial pH (6.0-9.0), fermentation time (24-96 h) and fermentation temperature (27-42℃) on the amino nitrogen content of fermented broth were evaluated. Using one-factor-at-a-time method, the fermentation time and temperature were selected as 72 h and 37 ℃, respectively. Subsequently, three variables including solid to liquid ratio (m/V), initial pH and glucose concentration were optimized by response surface methodology based on Box-Behnken design using the amino nitrogen content of fermented broth as the response. The optimal conditions for solid to liquid ratio, initial pH and glucose concentration were determined as 1:1.2, 8.8 and 3.13%, respectively. Experiments carried out under these conditions led to an amino nitrogen content of 2.457 mg/mL. Moreover, amino acid composition analysis demonstrated that the fermented squid minced meat was rich in glutamic acid (84.141 mg/g), aspartic acid (49.480 mg/g) and glycine (49.425 mg/g). These amino acids were responsible for umami and sweet taste characteristics with total content of 39.05%. The total essential amino acid concentration was 149.320 mg/g, accounting for 31.86% of all determined amino acids. In addition, the relative molecular weight distribution indicated that the fermented squid minced meat was composed of polypeptides, small peptides and free amino acids.

minced squid meat; Bacillus natto; fermentation; response surface methodology; amino acid composition; relative molecular weight distribution

TS254.9

A

1002-6630（2015）19-0148-05

10.7506/spkx1002-6630-201519026

2014-11-20

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201305013）；浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)重點(diǎn)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目 （2013C02003）；

2013年度國家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2013GA700260）；舟山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013C41008）

令狐青青（1994-），女，本科生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：952553230@qq.com

*通信作者：宋茹（1976-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與貯藏、食品化學(xué)與營養(yǎng)支持。E-mail：rusong@zjou.edu.cn