許 謙

（菏澤學(xué)院生命科學(xué)系，山東 菏澤 274015）

桑黃是一種珍稀藥用真菌，屬于多層孔菌科，針層孔菌屬，具有抗菌、抗癌、抗氧化等藥用功效［1］。民間用以治療淋病、崩漏帶下、癥瘕積聚、癖飲及脾虛泄瀉等［2，3］。桑黃含有多糖、黃酮、三萜等多種活性成分［4，5］，其黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗衰老等功能［6，7］。對桑黃黃酮的研究以往大部分集中在子實(shí)體黃酮的提取和分離［8－10］，對液體培養(yǎng)生產(chǎn)桑黃菌絲體黃酮的研究報(bào)道較少［11，12］。自然條件下桑黃子實(shí)體的獲得需要幾十年的時(shí)間，而適宜條件下液體培養(yǎng)桑黃菌絲體只需十幾天時(shí)間。雷萍等［13］研究表明，桑黃菌絲體黃酮含量比子實(shí)體還要高。所以利用液體培養(yǎng)基，可以高效生產(chǎn)桑黃菌絲體黃酮［14］。

天然黃酮化合物泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物，其基本母核為2-苯基色原酮，結(jié)構(gòu)中常連有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團(tuán)，常與糖類結(jié)合成苷，且因糖的種類、數(shù)量、聯(lián)接位置及方式不同組成各種類型。本研究在前期單因素試驗(yàn)過程中，考慮到黃酮組成成分的多樣性，及桑黃菌絲體生長對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，利用營養(yǎng)豐富、成本較低的基質(zhì)做單因素試驗(yàn)，確定了單因素試驗(yàn)最佳參數(shù)。本研究擬在此基礎(chǔ)上對生產(chǎn)菌絲體黃酮的液體培養(yǎng)基進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，以克服前人［12］研究中成本較高、黃酮產(chǎn)量較低的問題，為桑黃黃酮工業(yè)化生產(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

桑黃（PH001）：由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；

馬鈴薯、麩皮、玉米粉：山東菏澤牡丹區(qū)生產(chǎn)；

KH2PO4、葡萄糖：AR級，西隴化工股份有限公司；

MgSO4：AR級，天津凱通化學(xué)試劑有限公司；

AlCl3：AR級，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；

無水乙醇：AR級，濟(jì)南試劑總廠；

瓊脂：BR級，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

蛋白胨：BR級，北京奧博興生物技術(shù)有限公司；

蘆丁對照品：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋：MLS-3780型，Tega SANYO Industry Co.，Ltd；

雙層全溫振蕩器：HZQ-Y型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-2型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；

電熱恒溫水浴鍋：SY2-4型，北京市醫(yī)療設(shè)備廠；

可見分光光度計(jì)：723N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

（1）PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，切成小塊加蒸餾水1 000mL煮沸30min，4層紗布過濾，濾液中加葡萄糖20g和瓊脂20g，溶化后用蒸餾水補(bǔ)足至1 000mL，pH自然。121℃滅菌30min，倒平板。

（2）菌種活化：用打孔器（d＝1cm）取長滿菌絲的菌餅，每個(gè)平板接一個(gè)菌餅，28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)15d。

1.2.2 液體培養(yǎng)

（1）液體培養(yǎng)基配制方法：玉米粉和麩皮加適量蒸餾水煮沸30min，4層紗布過濾，加蛋白胨、KH2PO4和 MgSO4溶解后，定容，pH自然，分裝于250mL三角燒瓶中，每瓶150 mL，8層紗布封口，121℃滅菌30min。

接種量為每瓶2塊菌餅（d＝1cm），培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，液體培養(yǎng)時(shí)間18d。每種培養(yǎng)基3個(gè)重復(fù)。

（2）液體培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.2.3 AlCl3比色法（427nm）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參照文獻(xiàn)［14］。準(zhǔn)確稱量26mg蘆丁置于100mL容量瓶中，用60%乙醇溶解至刻度，分別移取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL于10mL容量瓶中，分別添加1%AlCl3稀釋至刻度，搖勻靜置10min，在427nm處測定吸光度，以蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。

1.2.4 菌絲體的黃酮產(chǎn)量測定 4層紗布過濾培養(yǎng)液，蒸餾水洗3遍，得菌絲球，烘干至恒重，稱重。

準(zhǔn)確稱取桑黃菌絲體（粉碎后過60目篩）0.5g，加60%乙醇15mL于70℃提取2h，流水冷卻，定容至25mL，過濾。取濾液5mL于10mL容量瓶中，添加1%AlCl3稀釋至刻度，搖勻靜置10min，在427nm處測定吸光度（做3個(gè)重復(fù)）。據(jù)回歸方程算出黃酮含量。并按式（1）計(jì)算黃酮產(chǎn)量。

圖1 AlCl3比色法（427nm）標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 AlCl3colorimetry（427nm）standard curve

式中：

Y——黃酮產(chǎn)量，mg/L；

C——黃酮含量，mg/g；

B——菌絲體生物量，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)計(jì)算結(jié)果

由表2可知，對菌絲體生物量的影響，4種因素影響水平由高到低依次為D＞C＞A＞B，菌絲體生物量最高的為配方6（A2B3C1D2），最低的為配方5（A2B2C3D1），最優(yōu)配方為 A3B3C2D2；對黃酮產(chǎn)量的影響，4種因素影響水平由高到低依次為C＞D＞B＞A，黃酮產(chǎn)量最高的為配方2（A1B2C2D2），最低的為配方1（A1B1C1D1），最優(yōu)配方為A3B3C2D2。

2.2 培養(yǎng)基配方各因素對黃酮產(chǎn)量及菌絲體生物量的影響

由表3可知，液體培養(yǎng)基配方4個(gè)因素中，B、C、D三因素對黃酮產(chǎn)量都有極顯著影響，因素A對黃酮產(chǎn)量的影響不顯著。

培養(yǎng)基配方各因素對黃酮產(chǎn)量影響的方差分析結(jié)果說明，因素A（碳源）盡管保證了菌絲體合成黃酮時(shí)對各種糖的需求，但對黃酮的產(chǎn)生并沒有造成顯著影響，其他因素B、C和D（蛋白胨，KH2PO4和MgSO4）對菌絲體黃酮產(chǎn)量均具有極顯著的影響，所以，黃酮產(chǎn)量主要是由培養(yǎng)基中的蛋白胨、KH2PO4、MgSO4決定。造成這種結(jié)果原因有三：① 蛋白胨為菌體生長提供充足的氮素營養(yǎng)，保證了代謝物黃酮的產(chǎn)生；②KH2PO4為菌體遺傳物質(zhì)的合成提供磷元素并且為協(xié)調(diào)菌體的正常生理功能提供鉀元素；③ MgSO4促進(jìn)了與黃酮合成有關(guān)酶的產(chǎn)生。

由表4可知，液體培養(yǎng)基配方4個(gè)因素中，A、C、D三因素對菌絲體生物量都有極顯著影響。B因素對菌絲體生物量有顯著影響。

培養(yǎng)基配方各因素對菌絲體生物量影響的方差分析結(jié)果說明，菌絲體生物量主要由培養(yǎng)基中的因素A、C和D（碳源、KH2PO4、MgSO4）決定，因素B（蛋白胨）對菌絲體的合成也起到顯著的作用。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)計(jì)算結(jié)果Table 2 Calculation results of L9（34）orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗(yàn)計(jì)算結(jié)果Table 2 Calculation results of L9（34）orthogonal test

菌絲體生物量及黃酮產(chǎn)量都是3個(gè)重復(fù)所得數(shù)據(jù)的平均值。

配方 A碳源 B蛋白胨 C KH2PO4D MgSO4菌絲體生物量/（mg·L－1）黃酮產(chǎn)量/（mg·L－1）1 1 1 1 1 11 836.00 66.50 2 1 2 2 2 18 812.33 201.23 3 1 3 3 3 16 029.33 170.11 4 2 1 2 3 22 415.11 190.38 5 2 2 3 1 11 281.33 68.96 6 2 3 1 2 22 503.00 154.37 7 3 1 3 2 20 225.67 145.92 8 3 2 1 3 18 897.55 130.34 9 3 3 2 1 18 702.89 195.23 菌絲體生物量k115 559.22 18 158.93 17 745.52 13 940.07 k218 733.15 16 330.41 19 976.78 20 513.67 k319 275.37 19 078.41 15 845.44 19 114.00 R 3 716.15 2 748.00 4 131.33 6 573.59黃酮產(chǎn)量k1 145.95 134.27 117.07 110.23 k2 137.90 133.51 195.61 167.17 k3 157.16 173.23 128.33 163.61 R 19.26 39.72 78.54 56.94

表3 培養(yǎng)基配方各因素對黃酮產(chǎn)量影響的方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonality of medium formula factors＇influence on flavone yield

表3 培養(yǎng)基配方各因素對黃酮產(chǎn)量影響的方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonality of medium formula factors＇influence on flavone yield

F0.05（2，18）＝ 3.54，F(xiàn)0.01（2，18）＝ 6.01。

差異源 平方和 自由度 均方和 F值 顯著性157.176 8 18 8.732 043 A 39.223 39 2 19.611 7 2.245 946 B 206.557 9 2 103.279 11.827 58 ＊＊C 722.943 1 2 361.471 5 41.395 99 ＊＊D 406.108 5 2 203.054 3 23.253 92 ＊＊誤差

表4 培養(yǎng)基配方各因素對菌絲體生物量影響的方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonality of medium formula’s influence on mycelium biomass

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表5可知，利用最優(yōu)配方（A3B3C2D2）、菌絲體生物量最高配方（A2B3C1D2）和黃酮產(chǎn)量最高配方（A1B2C2D2）進(jìn)行液體培養(yǎng)后，最優(yōu)配方獲得的菌絲體生物量和黃酮產(chǎn)量最高，對三者進(jìn)行方差分析，3種配方對菌絲體生物量和黃酮產(chǎn)量的影響差距顯著。綜合兩項(xiàng)指標(biāo)，A3B3C2D2為最優(yōu)配方，即：玉米粉3% ＋麩皮7%，蛋白胨2.0%，KH2PO40.10%，MgSO40.15%。用這個(gè)配方進(jìn)行桑黃生產(chǎn)，可以同時(shí)獲得菌絲體生物量高產(chǎn)及黃酮高產(chǎn)。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of the verification test（n＝3）（mg·L－1）

本試驗(yàn)菌絲體黃酮產(chǎn)量為212.35mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于趙子高等［11］試驗(yàn)所得（12.805 6mg/100mL）及劉凡等［12］試驗(yàn)所得（186.75mg/L）。造成這種差距可能有以下幾個(gè)原因：①培養(yǎng)基成分差異造成了菌絲體黃酮產(chǎn)量的較高差異，其中文獻(xiàn)［11］和［12］中沒有用到的蛋白胨成分是主要原因，另外本試驗(yàn)中麥麩的添加也是一個(gè)不可忽視的因素；② 較高轉(zhuǎn)速有利于好氧型桑黃菌絲體的生長及菌絲體黃酮的生產(chǎn)，文獻(xiàn)［11］和［12］中液體培養(yǎng)桑黃所用轉(zhuǎn)速為150r/min，本試驗(yàn)所用搖床轉(zhuǎn)速為160r/min；③ 較大的培養(yǎng)基裝入量適宜于菌種活性的長時(shí)間維持，為提高菌絲體產(chǎn)量和黃酮產(chǎn)量提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，提高了生產(chǎn)效率，文獻(xiàn)［11］和［12］中液體培養(yǎng)桑黃所用培養(yǎng)基裝入量為容器的2/5，本試驗(yàn)所用的液體培養(yǎng)基裝入量為容器的3/5。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交設(shè)計(jì)確定液體培養(yǎng)基配方，研究各配方對菌絲體生物量及黃酮產(chǎn)量的影響，最終通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定了優(yōu)化的液體培養(yǎng)基配方為A3B3C2D2（玉米粉3% ＋ 麥麩7%，蛋白胨2.0%，KH2PO40.10%，MgSO40.15%），菌絲體黃酮產(chǎn)量為212.35mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于趙子高［11］、劉凡［12］等的試驗(yàn)結(jié)果。而且本試驗(yàn)直接將平板活化的菌種定量接種在液體培養(yǎng)基里進(jìn)行正交分析試驗(yàn)，較文獻(xiàn)［11］和［12］增加了試驗(yàn)定量的準(zhǔn)確性，并簡化了一次接種工作。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，利用液體培養(yǎng)技術(shù)能夠在較短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量桑黃菌絲體及菌絲體黃酮，不受季節(jié)和環(huán)境的限制，可以大幅度降低桑黃黃酮作為新藥開發(fā)的成本。試驗(yàn)所確定的優(yōu)化液體培養(yǎng)基將對工業(yè)化生產(chǎn)桑黃菌絲體黃酮具有一定的指導(dǎo)意義，應(yīng)用前景廣闊。

1 弓建國.食用菌栽培技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2011.

2 劉波.中國藥用真菌［M］.太原：山西人民出版社，1974.

3 劉春輝，陳體強(qiáng)，林躍鑫.藥用真菌桑黃的研究進(jìn)展［J］.菌物研究，2004，2（2）：53～59.

4 劉艷芳，楊焱，賈薇，等.藥用真菌桑黃總黃酮測定方法研究［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2006，13（2）：45～48.

5 尹秀蓮，游慶紅.超聲輔助復(fù)合酶法提取桑黃多糖［J］.食品與機(jī)械，2011，27（4）：58～60.

6 夏國華.桑黃黃酮類成分及制劑研究［D］.鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2010.

7 王欽博.桑黃抗氧化活性成分的篩選及其分離純化［D］.上海：上海師范大學(xué)，2011.

8 孫錦秀.大孔吸附樹脂純化桑黃總黃酮工藝［J］.實(shí)用藥物與臨床，2012，15（11）：744～746.

9 陳曉平，于翠翠.響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助乙醇提取桑黃黃酮工藝的研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2013，49（4）：31～36.

10 夏國華，戈延茹，傅海珍，等.超聲法提取桑黃總黃酮的工藝研究［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，20（1）：40～41，55.

11 趙子高，楊炎，劉艷芳，等.桑黃黃酮高產(chǎn)菌株深層發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.中國釀造，2007（9）：22～25.

12 劉凡，龐道睿，沈維治，等.有利于桑黃胞內(nèi)黃酮的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方優(yōu)化［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2013，39（6）：1 160～1 165.

13 雷萍，張文雋，吳亞召，等.桑樹桑黃子實(shí)體和發(fā)酵菌粉有效成分分析［J］.中國食用菌，2010，29（4）：40～42.

14 宋鉑.桑黃黃酮的提取制備與生物活性初步研究［D］.上海：上海水產(chǎn)大學(xué)，2006.