李裕博 紀(jì)曉琳 劉 山 查 越 辛丘巖 啟 航

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

黃海海燕（Asterinapectinifera）俗稱海星，屬海星綱有棘目海燕科，常見于中國(guó)黃海、渤海一帶，是分布廣泛的海洋生物資源之一［1］，主要以扇貝、鮑魚、海膽等海珍品為食，對(duì)沿海的水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大的危害。黃海海燕除含有蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、微量元素和維生素等外，還含有大量結(jié)構(gòu)獨(dú)特且具有生物活性的代謝產(chǎn)物，具有良好的生理活性和藥理活性［2］。由于海洋動(dòng)物的生長(zhǎng)環(huán)境特殊，其在生理和藥理方面具有陸地生物所沒有的活性物質(zhì)如海燕皂苷、海參皂苷、蝦青素、深海魚油、鱟素，在抗氧化活性的研究方面具有潛在價(jià)值。到目前為止，具有抗氧化活性的酶解物已經(jīng)從許多類型的海洋生物中提取出來，例如魚類［3］、魷魚［4］、蝦類［5］、棘皮動(dòng)物［6］和雙殼類軟體動(dòng)物［7］。

劉小玲等［8］利用蛋白酶對(duì)羅非魚魚皮進(jìn)行酶解，經(jīng)試驗(yàn)表明，魚皮膠原肽對(duì)羥基具有一定的清除能力，且隨著膠原肽濃度的增加而增大。王蒞莎等［9］經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾柱從雌、雄鮑魚臟器粗多糖中各分離出兩種多糖組分，經(jīng)測(cè)定其清除羥基自由基的IC50分別為1.38，0.99，1.51，1.19mg/mL。任俊鳳等［10］通過木瓜蛋白酶酶解河豚魚皮提取膠原蛋白肽，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了研究，確定蛋白肽具有清除自由基的能力。盤賽昆等［11］通過對(duì)鳙魚肉進(jìn)行酶解制備抗氧化活性肽，結(jié)果表明，酶解物對(duì)羥基自由基的最高清除率可達(dá)到91.2%。張爽等［12］對(duì)鮑魚外套膜酶解物進(jìn)行了抗氧化活性的研究，測(cè)定酶解物清除DPPH自由基和羥基自由基的IC50分別為11.76，12.07mg/mL。周大勇等［13］利用胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)鮑魚內(nèi)臟進(jìn)行酶解，測(cè)得3種酶解物對(duì)DPPH自由基清除率的IC50值均為4 mg/mL，對(duì)羥基自由基清除率的IC50值分別為8，4，5mg/mL。顧明廣等［14］對(duì)魚皮膠原蛋白進(jìn)行酶解制備抗氧化肽，抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明，小分子量膠原蛋白清除DPPH自由基的能力由原膠原蛋白的26%提高到74%。

電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）又稱電子順磁共振，是在磁場(chǎng)中測(cè)量臨界狀態(tài)下未成對(duì)的電子的理論基礎(chǔ)上發(fā)展而來［15］，可以探測(cè)和識(shí)別具有未成對(duì)電子的分子，是檢測(cè)自由基最直接最有效的方法［16］。氧自由基容易引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致疾病發(fā)生，對(duì)機(jī)體危害極大。本試驗(yàn)主要以黃海海燕體壁為原料制備酶解物，應(yīng)用ESR技術(shù)檢測(cè)粗酶解物對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除作用，對(duì)不同酶種所得酶解物的清除效果進(jìn)行了對(duì)比，以期為黃海海燕體壁酶解產(chǎn)物在保健食品開發(fā)相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

黃海海燕（Asterinapectinifera）：大連太平洋海珍品有限公司；

胃蛋白酶：13 274U/g，上海生工生物股份有限公司；

胰蛋白酶：103 405U/g，上海生工生物股份有限公司；

中性蛋白酶：75 000U/g，南寧龐博生物工程有限公司；

DPPH：美國(guó)sigma-aldrich公司；

DMPO：優(yōu)級(jí)純，上海阿拉丁試劑有限公司；

其余試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 主要儀器設(shè)備

冷凍離心機(jī)：RC-6plus型，美國(guó)Virtis公司；

真空冷凍干燥機(jī)：ZKBTES-55型，美國(guó)Virtis公司；

干燥箱：PH070A型，上海一恒科技有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，予華儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：infiniteM200型，瑞士TECAN公司；

pH計(jì)：PB-10型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

電子順磁共振波譜儀：A200型，德國(guó)Bruker Opertics公司。

1.2 方法

1.2.1 黃海海燕的預(yù)處理 新鮮黃海海燕，去除內(nèi)臟，自來水清洗干凈后，于干燥箱中烘干。用1mol/L HCl浸泡，每6 h更換一次HCl，直至不再產(chǎn)生氣泡，用去離子水洗至中性，在干燥箱（80℃）中干燥24h后粉碎備用。

1.2.2 酶解液的制備 將8g粉碎后的黃海海燕體壁粉與100mL水混合，分別在胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶的最適條件下（胃蛋白酶37℃，pH 2.0；中性蛋白酶45℃，pH 7.0；胰蛋白酶37℃，pH 8.0）按照2 500U/g·底物加入酶，酶解3h，酶解結(jié)束后置于沸水浴中滅酶10min，4 000r/min離心20min，取上清冷凍干燥后將3種酶的酶解物按照濃度為10，20，30，40，50mg/mL的梯度配成酶解液，置于－80℃冰箱中保存，備用。

1.2.3 肽得率的測(cè)定 將經(jīng)過酶解的粗酶解液與10%TCA按照1∶1的比例混合均勻，靜置30min后，采用福林酚法測(cè)定肽得率［17］。

1.2.4 酶解液清除DPPH自由基活性測(cè)定 200μmol/L的DPPH溶液和不同濃度的粗酶解液混合，避光保存30 min，立即吸入毛細(xì)管，放入諧振腔，在中心磁場(chǎng)強(qiáng)度3 368.6 G；微波功率5.32mW；微波頻率9.44GHz；放大倍數(shù)1.42×104；調(diào)制幅度1.0G；調(diào)制頻率100kHz；時(shí)間常數(shù)81.92 ms；轉(zhuǎn)換時(shí)間40ms條件下掃描?？瞻捉M中粗酶解液用去離子水代替。以波譜信號(hào)第3個(gè)峰高值表示信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度，按式（1）計(jì)算清除率：

1.2.5 酶解液清除羥基自由基活性測(cè)定 將不同濃度的粗酶解液與羥基自由基體系混合，40℃水浴30min，立即吸入毛細(xì)管，放入諧振腔，在中心磁場(chǎng)強(qiáng)度3 369.08G；微波功率74.8mW；微波頻率9.44GHz；放大倍數(shù)1.00×105；調(diào)制幅度1.0G；調(diào)制頻率100kHz；時(shí)間常數(shù)163.84ms；轉(zhuǎn)換時(shí)間160ms條件下掃描，空白組中粗酶解液用去離子水代替，以波譜信號(hào)第2個(gè)峰高值表示信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度，按式（1）計(jì)算清除率：

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)中做3組平行，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式表示，利用SPSS對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用單向方差分析，P＜0.05被認(rèn)為是顯著的。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃海海燕體壁酶解物肽得率

由圖1可知，在中性蛋白酶和胰蛋白酶二者之間沒有顯著性差異，胃蛋白酶與其他兩種酶存在顯著性差異。此結(jié)果中胃蛋白酶組數(shù)據(jù)與黃鵬等［18］用胃蛋白酶酶解沙棘粕制備生物活性肽報(bào)道的肽得率4.58%大致相近；但與趙鴻霞等［19］報(bào)道用中性蛋白酶和胰蛋白酶酶解海參卵所得肽得率50.49%和30.51%的相比較低。

圖1 3種蛋白酶對(duì)黃海海燕體壁進(jìn)行酶解的肽得率Figure 1 The rate of peptide from the body wall of starfish Asterina pectinifera using the three proteases

2.2 酶解液對(duì)DPPH自由基的清除作用

本試驗(yàn)采用電子自旋共振（ESR）技術(shù)分別檢測(cè)不同濃度的黃海海燕體壁酶解液對(duì)DPPH自由基的清除效果，3種酶解液（胃蛋白酶組、中性蛋白酶組和胰蛋白酶組）對(duì)DPPH自由基都具有一定的清除效果（圖2），而且清除效果隨著酶解液濃度的升高而增強(qiáng)（圖3）。胃蛋白酶組、中性蛋白酶組和胰蛋白酶組對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50值分別為19.68，17.71，21.23mg/mL，對(duì)于較高濃度的黃海海燕體壁酶解液，中性蛋白酶的酶解液均具有較強(qiáng)的清除能力（P＜0.05）。趙雅娉等［20］利用胃蛋白酶對(duì)黃海海燕體壁進(jìn)行酶解制備膠原蛋白肽并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果證明，酶解物濃度為20mg/mL時(shí)胃蛋白酶酶解物對(duì)DPPH自由基的清除率為52%，這與本試驗(yàn)中IC50值相近。

圖2 3種蛋白酶酶解物對(duì)DPPH自由基的清除率Figure 2 The determination of scavenging rate of the three kinds of hydrolysate on DPPH radical

圖3 酶解物對(duì)DPPH自由基清除作用的ESR圖譜Figure 3 ESR spectrum of effects of hydrolysate on DPPH radical scavenging

2.3 酶解液對(duì)羥基自由基的清除作用

本試驗(yàn)采用電子自旋共振（ESR）技術(shù)檢測(cè)黃海海燕體壁對(duì)粗酶解液對(duì)羥基自由基的清除效果，3種酶解液（胃蛋白酶組、中性蛋白酶組和胰蛋白酶組）對(duì)羥基自由基都具有一定的清除效果，如圖4所示，而且清除效果隨著酶解液濃度的升高而增強(qiáng)（清除率由ESR峰值計(jì)算，如圖5所示），胃蛋白酶組、中性蛋白酶組和胰蛋白酶組對(duì)羥基自由基的清除能力的IC50值分別為15.17，11.94，16.65mg/mL。胃蛋白酶和中性蛋白酶酶解物對(duì)羥基自由基清除率沒有顯著差別（P＜0.05），但是在10mg/mL和20mg/mL條件下，中性蛋白酶組對(duì)羥基自由基具有顯著較高的清除率。

圖4 3種蛋白酶酶解物對(duì)羥基自由基的清除率Figure 4 The determination of scavenging rate of the three kinds of hydrolysate on hydroxyl radical

圖5 酶解物對(duì)羥基自由基清除作用的ESR圖譜Figure 5 ESR spectrum of effects of hydrolysate on hydroxyl radical scavenging

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，由胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶酶解黃海海燕體壁所得到的酶解物對(duì)DPPH自由基和羥基自由基都具有很好的清除作用，可以作為抗氧化清除自由基的良好原料。并且中性蛋白酶酶解物對(duì)DPPH自由基和羥基自由基具有明顯的清除能力，其對(duì)DPPH自由基和羥基自由基清除能力的IC50值分別為17.71，11.94mg/mL。黃海海燕體壁酶解液為開發(fā)新型功能性海洋食品基料提供了一定的理論依據(jù)，將提高黃海海燕的利用價(jià)值，并將擴(kuò)展ESR技術(shù)在水產(chǎn)品加工與檢測(cè)方面的應(yīng)用。

1 郭承華，張芳，劉迅，等.黃海產(chǎn)海燕黃海海燕皂甙的制備［J］.海洋通報(bào)，2000，19（2）：93.

2 汪行舟，安立龍.海星資源的開發(fā)現(xiàn)狀及發(fā)展［J］.資源開發(fā)與利用，2007，24（3）：31～34.

3 Je J Y，Lee K H，Lee M H，et al.Antioxidant and antihypertensive protein hydrolysates produced from tuna liver by enzymatic hydrolysis［J］.Food Research International，2009，42（9）：1 266～1 272.

4 Lin Lin，Li Ba-fang.Radical scavenging properties of protein hydrolysates from Jumbo flying squid（Dosidicus eschrichitii Steenstrup）skin gelatin［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2006，86（14）：2 290～2 295.

5 Guerard F，Sumaya-Martinez M T，Laroque D，et al.Optimization of free radical scavenging activity by response surface methodology in the hydrolysis of shrimp processing discards［J］.Process Biochemistry，2007，42（11）：1 486～1 491.

6 Mamelona J，Saint-Louis R，Pelletieré.Nutritional composition and antioxidant properties of protein hydrolysates prepared from echinoderm byproducts［J］.International Journal of Food Science＆Technology，2010，45（1）：147～154.

7 Dong Xiu-ping，Zhu Bei-wei，Zhao Hong-xia，et al.Preparation and in vitro antioxidant activity of enzymatic hydrolysates from oyster （Crassostrea talienwhannensis）meat［J］.International Journal of Food Science ＆ Technology，2010，45（5）：978～984.

8 劉小玲，林瑩，尹秀華，等.羅非魚皮膠原肽的制備及抗氧化活性研究［J］.食品與機(jī)械，2007，23（3）：92～95.

9 王蒞莎，朱蓓薇，周大勇，等.鮑魚臟器多糖的抗氧化活性研究［J］.食品與機(jī)械，2008，24（4）：65～69.

10 任俊鳳，任婷婷，朱蓓薇.河豚魚皮膠原蛋白肽的提取及其抗氧化活性的研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2009，9（1）：77～83.

11 盤賽昆，顧小紅，湯堅(jiān)，等.鳙魚肉酶解物清除羥基自由基的研究［J］.食品與機(jī)械，2008，25（4）：64～67.

12 張爽，朱蓓薇，董秀萍，等.不同分子質(zhì)量鮑魚外套膜酶解物抗氧化活性研究［J］.食品與機(jī)械，2012，28（3）：108～111.

13 Zhou Da-yong，Zhu Bei-Wei，Qiao Lu，et al.In vitro antioxidant activity of enzymatic hydrolysates prepared from abalone viscera［J］.Food ＆ Bioproducts Processing：Transactions of the Institution of Chemical Engineers Part C，2012，90（2）：148～154.

14 顧明廣，蘇芳，劉艷霞.酶解魚皮膠原蛋白制備抗氧化肽工藝研究［J］.食品與機(jī)械，2014，30（2）：149～151.

15 趙保路.電子自旋共振技術(shù)在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［M］.合肥：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，2009：58～59.

16 Falch E，Velasco J，Aursand M，et al.Detection of radical development by ESR spectroscopy techniques for assessment of oxidative susceptibility of fish oils［J］.European Food Research and Technology，2005，221（5）：667～674.

17 杜明，朱蓓薇，云霞，等.酶法水解松仁蛋白的最佳條件研究［J］.食品工業(yè)科技，2003（6）：36～38.

18 黃鵬，蘇寧，王昌濤.沙棘生物活性肽的制備及功效研究［J］.食品與機(jī)械，2010，26（6）：67～69.

19 趙鴻霞，周大勇，秦磊，等.響應(yīng)面法優(yōu)化海參卵酶解工藝［J］.食品與機(jī)械，2010，26（5）：114～117.

20 趙雅聘，劉山，趙鑫.黃海海燕體壁膠原蛋白肽的制備及其抗氧化活性［J］.食品研究與開發(fā)，2014，35（1）：5～8.