陳景春 陳 盛 何亞斌 鄭小平

（上海德諾產(chǎn)品檢測(cè)有限公司，上海 200436）

亞胺唑（imibenconazole），是一種新三唑類殺菌劑，能有效防治子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌所致的柑橘瘡痂病、葡萄黑痘病、梨黑星病等［1］。亞胺唑噴到作物上后能快速滲透到植物體內(nèi)，耐雨水沖刷，在推薦劑量下使用，對(duì)環(huán)境、作物安全，在蔬菜、果樹(shù)、禾谷類等作物的種植生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。亞胺唑在弱堿性條件下穩(wěn)定，在酸性和強(qiáng)堿性條件下不穩(wěn)定，對(duì)光穩(wěn)定。在雨水沖刷，土壤轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中，易污染地表水及水生動(dòng)植物。人攝入后，可能導(dǎo)致神經(jīng)性，甚至遺傳性中毒。亞胺唑原藥急性口服毒性：大鼠LD50為0.80g/kg，小鼠的LD50大于5.00g/kg［2］。GB/T 2763—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了：柑橘和蘋果的限量為1mg/kg，青梅和葡萄中限量為3mg/kg，但是無(wú)任何推薦使用的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

目前，用于測(cè)定亞胺唑的方法主要有氣相色譜法［2－5］和高效液相色譜法［6－8］。但是由于氣相色譜及液相色譜都是通過(guò)目標(biāo)物在分析中的保留時(shí)間來(lái)定性，并不能準(zhǔn)確地區(qū)分干擾物及目標(biāo)物。UPLC—MS/MS結(jié)合了LC的強(qiáng)大的分離分析能力和MS靈敏的鑒定及結(jié)構(gòu)解析能力，提供了可靠、精確的相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟，同時(shí)節(jié)省了樣品準(zhǔn)備時(shí)間和分析時(shí)間，GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法》中就利用UPLC—MS/MS的這一優(yōu)勢(shì)，同時(shí)對(duì)450種農(nóng)藥進(jìn)行了分析。為了更高效地測(cè)定蔬菜水果中亞胺唑殘留量，本研究擬通過(guò)固相萃取進(jìn)行凈化，采用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC—MS/MS）旨在為檢測(cè)亞胺唑含量提供更高的選擇性和靈敏度［9，10］。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

乙腈、正己烷、甲醇、丙酮：色譜純，美國(guó)西格瑪公司；

氯化鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

試驗(yàn)用水為去離子水；

亞胺唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；

弗羅里硅土（Florisil）固相萃取柱：500mg/6mL，美國(guó)沃特世公司。

1.2 儀器設(shè)備

超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQ型，美國(guó)沃特世公司；

分析天平：ML104型，瑞士梅特勒—托利多公司；

高速冷凍離心機(jī)：HeraeusMultifuge X1R型，美國(guó)熱電公司；

漩渦振蕩器：TALBOYS型，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；氮吹儀：DSY-Ⅲ型，北京東方精華苑科技有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱取5.00mg的標(biāo)準(zhǔn)品至50mL容量瓶中，用甲醇溶液配制成0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，于4℃冰箱中保存。

1.4 樣品制備

準(zhǔn)確稱取10.00g樣品，置于50mL離心管中，加入20 mL乙腈，均質(zhì)1min，加入5～8g氯化鈉，蓋緊瓶蓋于漩渦振蕩器上混勻，于4℃，8 000r/min離心5min，取上層有機(jī)相于100mL梨形瓶中；于殘?jiān)性偌尤?0mL乙腈，混勻后于4℃，8 000r/min離心5min，取上層有機(jī)相合并入100 mL梨形瓶中，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入5mL正己烷—丙酮溶液（4∶6，V/V）溶解殘?jiān)?，待凈化用?/p>

將Florisil固相萃取小柱用10mL正己烷—丙酮溶液（4∶6，V/V）預(yù)淋洗活化，加入上述待凈化溶液，用50mL梨形瓶接收洗脫液，加入25mL正己烷—丙酮溶液（4∶6，V/V）沖洗100mL梨形瓶后淋洗Florisil固相萃取小柱，收集洗脫液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。用1mL甲醇—水（5∶5，V/V）溶液溶解，經(jīng)0.22μm的有機(jī)相濾膜過(guò)濾，待上機(jī)分析。

1.5 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH C18（1.7μm，2.1mm ×100 mm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈（梯度條件見(jiàn)表1）；流速為0.3mL/min；進(jìn)樣體積：5μL；柱溫：40℃。

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓：1.0kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑流量：800L/h；脫溶劑溫度：400℃；定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見(jiàn)表2。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 The elution conditions of mobile phase

表2 測(cè)定亞胺唑的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 The MS parameters for detecting Imibenconazole

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化方法的確定

根據(jù)化學(xué)性質(zhì)，亞胺唑易溶于甲醇、乙腈、苯、二甲苯、丙酮中，在水中的溶解度較低。乙腈作為一種通用的提取溶劑在殘留檢測(cè)方面得到廣泛的應(yīng)用，由于其與蛋白質(zhì)、脂肪類化合物難溶，對(duì)絕大多數(shù)農(nóng)藥有較高的回收率，本試驗(yàn)結(jié)果表明乙腈適合作為蔬菜水果中亞胺唑的提取試劑。在提取液中加入氯化鈉，增加水的比重與保證乙腈分層，再經(jīng)固相萃取凈化，可以得到滿足凈化要求的樣品。選用C18固相萃取柱和Florisil固相萃取柱以及石墨碳黑固相萃取柱進(jìn)行凈化比較，結(jié)果表明，亞胺唑在C18固相萃取柱和石墨碳黑固相萃取柱中有吸附，雖然選用石墨碳黑固相萃取柱能更有效地去除樣品中的色素，但目標(biāo)物也會(huì)同時(shí)被吸附，柱效回收率在60%左右。選擇Florisil固相萃取柱進(jìn)行濃縮凈化后，干擾較低，回收率高。因此，本試驗(yàn)選擇Florisil固相萃取柱進(jìn)行凈化。

2.2 儀器條件的確定

圖1 亞胺唑標(biāo)準(zhǔn)品圖譜Figure 1 The UPLC—MS/MS of Imibenconazole

亞胺唑標(biāo)準(zhǔn)品圖譜見(jiàn)圖1。本試驗(yàn)采用乙腈水溶液（0.1%甲酸）作為流動(dòng)相；流動(dòng)相中加入0.1%甲酸，增加了目標(biāo)化合物在噴霧之前的離子化程度，提高了檢測(cè)的靈敏度；由于亞胺唑極性較小，在流動(dòng)相梯度上選擇較高比例的有機(jī)相來(lái)保證目標(biāo)化合物的完全洗脫。

2.3 線性關(guān)系及檢出限

準(zhǔn)確移取亞胺唑儲(chǔ)備液適量，用不同基質(zhì)稀釋成一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其濃度分別為1.0，10.0，20.0，50.0，100.0μg/L。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)組分峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明（見(jiàn)表3）：亞胺唑在這些基質(zhì)中在1.0～100.0μg/L范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r大于0.998。當(dāng)亞胺唑添加濃度為1.0μg/kg時(shí)，測(cè)得質(zhì)譜峰信噪比S/N＞3，亞胺唑添加濃度為3.0μg/kg時(shí)，測(cè)得質(zhì)譜峰信噪比S/N＞10，則該方法檢出限為1.0μg/kg，定量限為3.0μg/kg。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

本試驗(yàn)選擇了青菜、蘋果、生菜、草莓、芹菜和梨等6種不同種類的蔬菜水果陰性樣品，進(jìn)行3個(gè)不同水平（1.0，5.0，20.0μg/kg）的添加回收試驗(yàn)，測(cè)定后得到亞胺唑在不同基質(zhì)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見(jiàn)表4。由表4可知：符合農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)的要求［11］。

表3 亞胺唑標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 The standard curve of Imibenconazole

表4 亞胺唑加標(biāo)回收率及精密度測(cè)定結(jié)果Table 4 The recovery rate of Imibenconazole in samples

3 結(jié)束語(yǔ)

本試驗(yàn)建立了蔬菜與水果中亞胺唑殘留量的超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC—MS—MS）檢測(cè)方法。與文獻(xiàn)［2］和［4］中采用的氣相及液相方法相比較，本試驗(yàn)在定性上更加準(zhǔn)確，檢出限能達(dá)到1.0μg/kg，靈敏度有了很大的提高。采用Florisil固相萃取柱凈化，消除了樣品中的蛋白、脂類等干擾物質(zhì)。但Florisil固相萃取柱吸附色素的能力有限，檢測(cè)色素含量較高的樣品時(shí)不能完全吸附色素，對(duì)試驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生干擾。通過(guò)使用GPC進(jìn)行凈化可能會(huì)得到更好的凈化效果。

1 畢強(qiáng)，余鯨年.Imibenconazole——一種新的殺菌劑［J］.農(nóng)藥譯叢，1996，18（4）：63～64.

2 李薇，趙文芳，冷欣夫.梨果及土壤中亞胺唑及其代謝物的氣相色譜分析［J］.色譜，1998，16（6）：508～509.

3 熊芳，戴華，黃志強(qiáng).氣相色譜法測(cè)定葡萄中烯唑醇農(nóng)藥的殘留量［J］.色譜，2002，20（4）：383～384.

4 周芳梅，蔡雙福，文燦，等.亞胺唑在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的檢測(cè)方法及持久性研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（1）：234～237.

5 黃士忠，王繼軍，黃永春，等.酰胺唑及其代謝物在柑橘和土壤中的殘留動(dòng)態(tài)研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23（1）：181～185.

6 Akiko Kaihara，Kimihiko Yoshii，Yukari Tsumura，et al.Multiresidue analysis of pesticides in fresh fruits and vegetables by supercritical fluid Extraction and HPLC［J］.Journal of Health Science，2000，46（5）：336～342.

7 熊芳，戴華，李擁軍，等.高效液相色譜法測(cè)定葡萄中烯唑醇農(nóng)藥殘留量［J］.農(nóng)藥，2002，43（8）：22～23.

8 全國(guó)農(nóng)藥殘留實(shí)驗(yàn)研究協(xié)作組編.農(nóng)藥殘留量實(shí)用檢測(cè)方法手冊(cè) （第二卷）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：428～437

9 王巖松，張春暉，張春野，等.高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定 蔬菜和水果中氟嗎啉的殘留量［J］.分析化學(xué)研究報(bào)告，2012，40（2）：286～291.

10 劉長(zhǎng)令.世界農(nóng)藥大全 殺菌劑卷［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版，2006：80～82.

11 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，山西省農(nóng)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.NY/T 788—2004農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則［S］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.