趙玉萍 唐梓鑫 楊 莉 馮云琪

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223001）

凹凸棒石黏土是一種具有一維納米棒晶結(jié)構(gòu)的天然非金屬富鎂鋁硅酸鹽黏土礦物，簡(jiǎn)稱凹土。凹土顯微結(jié)構(gòu)包括3個(gè)層次：凹土的基本結(jié)構(gòu)單元是微棒狀或纖維狀的一維納米結(jié)構(gòu)，是針狀晶體；由棒晶結(jié)構(gòu)緊密平行聚集而形成了棒晶束；棒晶束間或棒晶間相互聚集堆積成了各種層鏈狀的聚集體［1－3］。由于凹土晶體顆粒細(xì)小，因此外表面積很大，而其特有的晶體結(jié)構(gòu)和堆積方式又形成了大量的孔道結(jié)構(gòu)，因此內(nèi)表面積也很大，使得凹土具有很強(qiáng)的吸附能力［1，2］。另外，凹土還具有很好的生物親和性［3］以及減少益生菌受胃腸道逆環(huán)境的損傷［4，5］。目前鮮有關(guān)于凹土對(duì)益生菌吸附性能和保護(hù)機(jī)理的報(bào)道。本研究擬優(yōu)化凹土對(duì)乳酸球菌的吸附條件，并對(duì)相關(guān)吸附性能進(jìn)行研究，旨在為凹土作為益生菌保護(hù)劑的機(jī)理研究作一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸球菌：本實(shí)驗(yàn)室保藏；

紫外光柵分光光度計(jì)：752型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：TGC-16G-A型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

恒溫雙向磁力攪拌器：90-3型，上海振榮科學(xué)儀器有限公司；

MRS培養(yǎng)基［6］：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氫二銨2g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，吐溫-80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，H2O 1L，pH 6.2～6.4，121℃滅菌15min；

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖：生化試劑，日本Sigma公司；

其他試劑：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 凹土的純化 將未經(jīng)處理的凹土研磨，過(guò)200目篩，以10%的量加入去離子水，磁力攪拌器攪拌24h后，靜置4 h，取中間層凹土懸液，以10%的量加入去離子水，重復(fù)3次［4］。

1.2.2 菌懸液的配置 取10mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期菌液，此時(shí)，菌懸液在600nm處測(cè)定吸光度OD值為1.3左右，菌落為1.68×1010CFU，于5 000r/min離心10min，棄上清，用無(wú)菌生理鹽水洗滌深沉兩遍，最后將菌體懸浮于生理鹽水中，配制成所需濃度。

1.2.3 離心條件的確定 將OD值相近的菌懸液和凹土懸液分別置于不同離心管，并分別加入80%的蔗糖溶液，離心，測(cè)上清液OD值。當(dāng)凹土懸液上清液OD值接近于0而菌懸液上清液OD值與原來(lái)接近時(shí)，該離心條件作為測(cè)定吸附的條件［7］。

1.2.4 凹土活化最佳酸堿的確定 以濃度分別為0.6，0.8，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0mol/L 的 H2SO4、H3PO4、HCl、CH3COOH 和濃度分別為3.0，5.0，8.0，10.0，15.0mol/L的NaOH和KOH活化處理凹土，液固比為10∶1（V∶m），活化30min，再用生理鹽水離心洗滌2次，待用［8，9］。

將活化好的凹土和菌懸液離心后的菌泥一起懸浮在10 mL的生理鹽水中，振蕩器充分混合均勻后轉(zhuǎn)移到50mL三角瓶中，放置于37℃，150r/min的搖床上振蕩2h。振蕩結(jié)束后，取振蕩后的混合液至離心管中，在最佳離心條件下離心，取上清液，測(cè)其OD值，確定凹土預(yù)處理的最佳酸或堿。

1.2.5 緩沖液最佳摩爾濃度的確定 將活化好的凹土和菌懸液離心后的菌泥一起懸浮在摩爾濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mol/L的 NaH2PO4—Na2HPO4緩沖液中，按1.2.4確定最佳摩爾濃度。

1.2.6 緩沖溶液最佳pH和最佳吸附時(shí)間的確定 將活化好的凹土和菌泥一起懸浮在pH分別為6.0，7.0，8.0的無(wú)菌NaH2PO4—Na2HPO4緩沖液中，于37℃，150r/min的搖床上分別振蕩20，40，60，80，100，120min，按1.2.4方法確定最佳pH。

1.2.7 吸附等溫線的繪制 在上述最佳吸附條件下，將凹土懸浮于最佳緩沖體系中，濃度為4g/L，分別吸附濃度為4.4，4.8，5.2，5.6，6.0，6.4，6.8，7.2g/L的乳酸球菌，充分吸附，考察溫度、菌體濃度對(duì)吸附的影響，繪制吸附等溫線［10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳離心條件的確定

凹土懸液和菌懸液OD值為1.269，在不同轉(zhuǎn)速下離心不同時(shí)間后，測(cè)上清液OD值，所得結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同離心條件下懸液的OD值Table 1 Determination of centrifugal conditions

由表1可知，當(dāng)在800r/min離心2min時(shí)，菌的OD值接近起始值，說(shuō)明菌基本沒(méi)有沉降，而凹土OD值接近0，說(shuō)明該條件下凹土基本沉降，故最佳離心轉(zhuǎn)速為800r/min，離心時(shí)間為2min。

2.2 預(yù)處理凹土最佳酸或堿的確定

用不同濃度的酸和堿處理純化凹土，再用預(yù)處理過(guò)的凹土吸附乳酸球菌，在800r/min離心2min，測(cè)上清液吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖1、2。

圖1 不同酸預(yù)處理凹土懸液吸光度值Figure 1 Results of different acids pretreating attapulgite

綜合圖1、2可知，用堿預(yù)處理凹土對(duì)乳酸球菌的吸附效果普遍不如酸。鹽酸和硫酸預(yù)處理效果又不如磷酸和乙酸。由圖1還可知，用濃度為1mol/L的磷酸處理凹土對(duì)乳酸球菌的吸附效果最佳，吸光度值最小。酸或堿預(yù)處理凹土，可除去分布于凹土微觀孔道結(jié)構(gòu)中的雜質(zhì)，疏通孔道，從而有利于吸附過(guò)程中吸附質(zhì)分子在孔道結(jié)構(gòu)中的擴(kuò)散。用酸處理的效果較好，還可能是因?yàn)镠＋置換了凹土層結(jié)構(gòu)中的陽(yáng)離子，如Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋等，使孔容積得到了進(jìn)一步增大，并且使原來(lái)層間的鍵力得到了削弱，使得層狀晶格得到了一定程度的開(kāi)裂，孔道得到進(jìn)一步的疏通，比表面積得到了進(jìn)一步的增加，提高了吸附能力［11］。

圖2 不同堿預(yù)處理凹土懸液吸光度值Figure 2 Results of different alkalis pretreating attapulgite

2.3 緩沖液最佳摩爾濃度的確定

為探究磷酸緩沖液的摩爾濃度對(duì)凹土吸附乳酸球菌性能的影響，選擇pH 6，研究緩沖液不同摩爾濃度對(duì)吸附效果的影響，測(cè)定上清液吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 緩沖液的摩爾濃度對(duì)吸附效果的影響Figure 3 Effects of different concentrations of buffer on the adsorption

由圖3可知，隨著緩沖液摩爾濃度的增加，吸光度值先減少后增加，即凹土對(duì)乳酸球菌的吸附先增大，后減小，當(dāng)緩沖液摩爾濃度為0.4mol/L時(shí)，吸附率達(dá)到最大，因此凹土吸附乳酸球菌時(shí)緩沖液的最佳摩爾濃度為0.4mol/L。

2.4 緩沖液最佳pH和最佳吸附時(shí)間的確定

選擇摩爾濃度為0.4mol/L的磷酸鹽緩沖液，研究不同的pH對(duì)凹土吸附乳酸球菌的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，pH＝6和7時(shí)，吸附在60min時(shí)基本達(dá)到飽和，而pH＝8時(shí)，吸附在40min就達(dá)到飽和，但飽和吸附效果沒(méi)有微酸性和中性好，因此選擇pH 6作為最佳吸附pH。同時(shí)可以看出，凹土對(duì)乳酸球菌的吸附，隨著吸附時(shí)間的增加，吸附量先逐漸增大，然后趨于穩(wěn)定，之后吸附量保持不變。前60min，凹土對(duì)乳酸球菌的吸附很快，之后吸附速度明顯變慢，60min基本達(dá)到吸附平衡，因此凹土對(duì)乳酸球菌的最佳吸附時(shí)間為60min。

2.5 吸附等溫線結(jié)果

選擇幾組不同濃度的乳酸球菌菌液進(jìn)行等溫吸附試驗(yàn)，以平衡質(zhì)量濃度pe對(duì)平衡吸附量qe作圖，得到凹土吸附乳酸球菌的吸附等溫線，見(jiàn)圖5。

圖4 不同pH和時(shí)間的緩沖液對(duì)吸附效果的影響Figure 4 Effects of different pH of buffer and time on the adsorption

圖5 吸附等溫線Figure 5 Adsorption isotherm curve

由圖5可知，隨著溫度的升高，凹土對(duì)乳酸球菌的吸附量增大，而且隨著平衡濃度的增大，平衡吸附量先增大，然后趨于平緩。

按照公式和表中數(shù)據(jù)進(jìn)行Langmuir和Freundlich方程線性擬合，結(jié)果見(jiàn)表2、3。

對(duì)比表2和表3可知，表2中理論推導(dǎo)的單層飽和吸附量qm與試驗(yàn)所得飽和吸附量q比較接近，且R12均普遍大于R22，因而在試驗(yàn)研究的溫度和濃度范圍內(nèi)，凹土對(duì)乳酸球菌的吸附能夠較好地符合Langmuir吸附等溫方程。隨著溫度升高，單層飽和吸附量qm增大，表明此吸附是吸熱過(guò)程，即升溫有利于凹土對(duì)乳酸球菌的吸附。由于b＞0，且有0＜RL＝1/（1＋bp0）＜1，即凹土對(duì)乳酸球菌的吸附為優(yōu)惠吸附。

表2 Langmuir線性擬合結(jié)果Table 2 The fitting results of Langmuir

表3 Freundlich線性擬合結(jié)果Table 3 The fitting results of Freundlich

3 結(jié)論

本研究對(duì)凹土進(jìn)行純化，研究了純化凹土對(duì)乳酸球菌的最佳吸附條件。主要考察了吸附時(shí)間、緩沖液pH值、摩爾濃度以及溫度等因素對(duì)凹土吸附乳酸球菌的影響。通過(guò)用H2SO4、H3PO4、HCl、CH3COOH、KOH 和 NaOH 預(yù)處理凹土可知，采用1mol/L的H3PO4預(yù)處理凹土，對(duì)乳酸球菌的吸附效果最好。在pH 6、0.4mol/L的磷酸鹽緩沖液體系中，凹土對(duì)乳酸球菌的吸附在60min內(nèi)基本完成，達(dá)到吸附平衡，是最佳的吸附條件。在試驗(yàn)的pH范圍內(nèi)，凹土對(duì)乳酸球菌的吸附速率隨pH的升高而變慢，說(shuō)明吸附適宜在偏酸性的條件下進(jìn)行。凹土對(duì)乳酸球菌的吸附能夠較好地符合Langmuir吸附等溫方程。隨著溫度的升高，凹土對(duì)乳酸球菌的平衡吸附量增大，表明此吸附是吸熱過(guò)程。當(dāng)乳酸球菌的濃度增大時(shí)，平衡吸附量也在增大。凹土對(duì)乳酸球菌的吸附過(guò)程屬于優(yōu)惠吸附。

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