趙 陽(yáng) 陳海華 王雨生，2 劉朝龍 趙春霞

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，山東 青島 266109）

風(fēng)味是影響食品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，酶解動(dòng)物蛋白因具有自然、醇厚、濃郁的特征風(fēng)味，已經(jīng)逐步代替化學(xué)調(diào)味料，成為制備高檔復(fù)合調(diào)味品的重要基料［1］。紫貽貝又稱(chēng)海紅，在中國(guó)資源豐富，年產(chǎn)量達(dá)50萬(wàn)t［2］。紫貽貝的蛋白酶解液含有豐富的呈味氨基酸、呈味肽、有機(jī)酸等呈味物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)豐富、海鮮風(fēng)味純正自然。本課題組［2］在前期研究中，已通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化了酶解紫貽貝最佳工藝條件，制得呈味物質(zhì)含量較高、整體風(fēng)味良好的紫貽貝酶解液，并對(duì)其中呈味物質(zhì)進(jìn)行了成分分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶解液中呈味物質(zhì)的含量隨酶解條件的改變表現(xiàn)出規(guī)律變化，且酶解液的風(fēng)味特征與呈味肽的結(jié)構(gòu)之間存在一定聯(lián)系。

關(guān)于水產(chǎn)蛋白，尤其是貝類(lèi)蛋白酶解過(guò)程中呈味物質(zhì)釋放規(guī)律的研究較少。肖如武等［3］研究表明，馬氏珍珠貝肉蛋白的酶解過(guò)程中，酶解液中游離氮基酸和可溶性氮含量增加，肽分子量降低，鮮味增強(qiáng)、苦味先增強(qiáng)后減弱。崔春［4］研究表明，海魚(yú)蛋白酶解過(guò)程中，酶解液中游離氨基酸含量持續(xù)增加，多肽、總酸、總糖含量先增加后降低。趙珊珊等［5］研究表明，不同酶解工藝條件下，游離氨基酸、呈味肽的釋放量和釋放速率不同。呈味肽結(jié)構(gòu)的研究，主要集中于肉味肽的分子量分布和氨基酸測(cè)序。研究呈味肽的結(jié)構(gòu)，須對(duì)其進(jìn)行分離純化，其方法主要有硫酸銨鹽析、超濾法、陰離子交換樹(shù)脂分離、凝膠柱層析、高效液相質(zhì)譜法等，氨基酸測(cè)序方法以基質(zhì)輔助激光解析—三級(jí)四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜法為主。目前國(guó)內(nèi)外大多研究中所采用的多肽分離純化方法較為單一，借助多種方法對(duì)多肽進(jìn)行逐級(jí)分離純化的研究較少。伍彬［6］采用超濾法、大孔吸附樹(shù)脂和高效凝膠過(guò)濾色譜分離純化并鑒定了蝦頭自溶產(chǎn)物中的低分子量肽，結(jié)果表明鮮味肽和甜味肽分子量主要集中在1～3kDa。肖如武［1］采用超濾技術(shù)、大孔吸附樹(shù)脂、凝膠柱層析分離純化了藍(lán)蛤肉酶解產(chǎn)物肽，最終得到純度較高的鮮味肽，其鮮味強(qiáng)度為谷氨酸鈉的3倍。張艷萍等［7］對(duì)紫貽貝酶解物中的降血壓肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，相對(duì)分子質(zhì)量＜1kDa肽占降血壓肽總量的90.42%。以上研究，均未對(duì)呈味肽的釋放規(guī)律和結(jié)構(gòu)之間的內(nèi)在聯(lián)系作出深入探討。

本試驗(yàn)擬研究紫貽貝酶解液中呈味物質(zhì)的釋放規(guī)律，測(cè)定呈味肽結(jié)構(gòu)，以探討其構(gòu)效關(guān)系。以不同條件下制備的紫貽貝酶解液為研究對(duì)象，測(cè)定其總酸、總糖、三甲胺等呈味物質(zhì)含量，以及肽分子量分布、氨基酸組成，結(jié)合酶解液的感官評(píng)分，研究各種呈味物質(zhì)的釋放規(guī)律，并以酶解液各級(jí)純化產(chǎn)物的鮮味評(píng)分作為指標(biāo)，借助多級(jí)超濾、凝膠柱層析和反相高效液相色譜法對(duì)海鮮風(fēng)味肽進(jìn)行逐步分離純化，采用超高分辨四極桿—飛行時(shí)間質(zhì)譜確定海鮮風(fēng)味肽的氨基酸序列，以期為紫貽貝蛋白呈味肽的制備、分離純化、結(jié)構(gòu)研究及其在調(diào)味品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫貽貝：青島城陽(yáng)水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)；

中性蛋白酶：5×104U/g，石家莊市興達(dá)酶制劑有限公司；

木瓜蛋白酶：8×105U/g，鄭州坤利食品添加劑有限公司；

葡聚糖凝膠 G-25（Sephadex G-25）：瑞典 Pharmacia公司；

乙腈：色譜純，天津恒興化學(xué)試劑；

三氟乙酸（TFA）：色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；

肽分子量標(biāo)準(zhǔn)品：谷胱甘肽（分子量0.31kDa），血管緊張素（分子量1.30kDa），胰島素（分子量 5.81kD），溶菌酶（分子量14.00kDa），美國(guó)Sigma公司。

其它試劑：均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

超高分辨四極桿—飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：UHR-Q-TOF型，德國(guó)Bruker公司；

高效液相色譜：LC-20A型，日本島津公司；

全自動(dòng)氨基酸分析儀：L-8900型，日立高新技術(shù)公司；

酸度計(jì)：DELTA320型，瑞士Mettler-Toledo集團(tuán)；

超濾裝置：EZ-FitTM型，美國(guó) Millipore公司；

電腦紫外檢測(cè)器：HD-5型，上海青浦滬西儀器廠；

自動(dòng)部分收集器：BSC-100型，上海青浦滬西儀器廠；

低速離心機(jī)：LXJ-IIB型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 紫貽貝酶解液的制備 根據(jù)文獻(xiàn)［2］制備紫貽貝酶解液（mussel protein hydrolyses，MPHs）。取冷凍紫貽貝肉于磷酸緩沖液（pH 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5；0.2mol/L）中，按固液比1∶3（m∶V）進(jìn)行勻漿，按酶活1∶1的比例加入一定量中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，適宜溫度酶解一定時(shí)間后，沸水浴滅酶20min，冷卻，4 000r/min離心20min，取上清液定容至500mL，即得MPHs。其中：分別在酶解時(shí)間2h、酶解溫度50℃、酶解pH 6.5的條件下，固定其中的2個(gè)因素，在酶解時(shí)間1～3h、酶解溫度40～60℃、酶解pH 5.5～7.5的范圍內(nèi)，改變另外1個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 紫貽貝酶解液中呈味物質(zhì)的測(cè)定

（1）總酸的測(cè)定：根據(jù)ASTM D2942-02（2013）Standard Test Method for Total Acid Acceptance of Halogenated Organic Solvents（Nonreflux Methods）及 GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》規(guī)定的方法測(cè)定酶解液中總酸含量。

（2）總糖的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)［8］及 GB/T 9695.31—2008《肉制品 總糖含量測(cè)定》，采用苯酚—硫酸法測(cè)定酶解液中總糖含量。

（3）三甲胺（trimethylamine，TMA）的測(cè)定：采用比色法［9］。

1.3.3 紫貽貝酶解液中的肽分子量分布和氨基酸分析

（1）肽分子量分布：根據(jù)文獻(xiàn)［10］，采用HPLC法測(cè)定紫貽貝酶解液中呈味物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。色譜條件：Shodex KW-802.5（7.8mm×300mm）色譜柱；流動(dòng)相：乙腈—水—三氟乙酸，三者體積比 45∶55∶0.1；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；柱溫：30℃。相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品：谷胱甘肽（分子量0.31kDa），血管緊張素（分子量1.30kDa），胰島素（分子量5.81kD），溶菌酶（分子量14.00kDa）。根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)樣的洗脫時(shí)間得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

式中：

Mw——相對(duì)分子質(zhì)量，Da；

t——出峰時(shí)間，min。

取適量酶解物，溶解后經(jīng)0.45m微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣分析。根據(jù)肽標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定紫貽貝酶解液中肽的分子量。

（2）氨基酸分析：總氨基酸組成、游離氨基酸組成：分別按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》、文獻(xiàn)［11］，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定。肽基氨基酸含量按式（2）計(jì)算：

式中：

X——肽基氨基酸含量，mg/mL；

X1——總氨基酸含量，mg/mL；

X2——游離氨基酸含量，mg/mL。

1.3.4 紫貽貝海鮮風(fēng)味肽的分離純化

（1）紫貽貝海鮮風(fēng)味肽的超濾分離：取適量在50℃、pH 6.5條件下酶解2h后的紫貽貝酶解液，采用截留分子量為10kDa的超濾膜在0.4MPa、（4±0.5）℃條件下進(jìn)行分離，當(dāng)截留液體積減少到原樣品液體積的10%時(shí)停止，取透過(guò)液進(jìn)行下一級(jí)超濾處理，利用截留分子質(zhì)量分別為5，3，1kDa的超濾膜依次進(jìn)行上述操作，收集各級(jí)超濾組分，冷凍干燥后進(jìn)行鮮味分析。

（2）凝膠柱層析法分離純化紫貽貝海鮮風(fēng)味肽：將超濾分離所得的鮮味最高的組分配成質(zhì)量濃度為40mg/mL的溶液，用Sephadex G-25凝膠柱層析（26mm×400mm）進(jìn)行分離。進(jìn)樣量為1.0mL，洗脫液為去離子水，流速為2.0mL/min，檢測(cè)220nm處的吸光值。對(duì)各分離組分峰進(jìn)行收集，冷凍干燥后，進(jìn)行風(fēng)味分析，收集海鮮風(fēng)味最佳的峰凍干后備用。

（3）反相高效液相色譜法分離純化紫貽貝海鮮風(fēng)味肽：將凝膠層析分離得到的呈味組分溶解于90%的乙腈中，0.22μm濾膜過(guò)濾后，參照文獻(xiàn)［12］，采用島津 LC-20A高效液相色譜，Zorbax SB-C18（5μm，4.6mm×250mm）反相色譜柱驗(yàn)證純度。

分離條件：進(jìn)樣量10μL，流速0.5mL/min，A流動(dòng)相，含0.1%三氟乙酸的超純水；B流動(dòng)相，含0.1%三氟乙酸的乙腈；以10%B流動(dòng)相等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)220，280nm。

1.3.5 超高分辨四極桿—飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定海鮮風(fēng)味肽氨基酸序列 將反相高效液相色譜分離得到的海鮮風(fēng)味肽溶解于50%乙腈溶液中（含有1‰甲酸），采用超高分辨四極桿—飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定氨基酸序列。

操作條件：離子源：ESI；掃描模式：正離子，全掃描；掃描范圍（m/z）103～1 000；碎裂電壓：100V；毛細(xì)管電壓：4.5kV；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：11L/min；霧化氣：2.90×105Pa。

圖1 酶解條件對(duì)紫貽貝酶解液中總酸和總糖的影響Figure 1 Effect of enzymatic conditions on the total acid and total saccharides of Mytilus edulis enzymolysate

1.3.6 感官評(píng)定 由8位經(jīng)過(guò)適當(dāng)培訓(xùn)的感官評(píng)價(jià)員組成品嘗小組，根據(jù)文獻(xiàn)［13］、［14］的方法進(jìn)行感官評(píng)定。對(duì)紫貽貝酶解液的各級(jí)超濾液鮮味、苦味進(jìn)行評(píng)分，采用5分制，0～5分由低到高，分別代表風(fēng)味程度“很弱、較弱、一般、較強(qiáng)、很強(qiáng)”。采用TDA（taste dilution analysis）法對(duì)海鮮風(fēng)味肽進(jìn)行評(píng)定，其中不少于6名感官評(píng)定員能夠準(zhǔn)確評(píng)價(jià)的最高樣品濃度，即為樣品在水中的呈味閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 呈味物質(zhì)的釋放規(guī)律

2.1.1 酶解條件對(duì)酶解液中總酸和總糖含量的影響 貝類(lèi)中的酸主要包括乳酸、丙酸、琥珀酸等有機(jī)酸，具有提高酶解液緩沖能力、增強(qiáng)呈味特性的作用［5］。酶解液中的總糖包括以游離形式存在的葡萄糖、半乳糖、果糖等，各種糖的含量均遠(yuǎn)低于其呈味閾值，故其對(duì)酶解液甜味的影響不大［5］。但糖與其他物質(zhì)之間的相互作用可能影響酶解液的整體風(fēng)味［13］。由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)、酶解溫度的升高，紫貽貝酶解液的總酸含量均呈先升高后降低的趨勢(shì)，分別在酶解時(shí)間1h、酶解溫度50℃時(shí)達(dá)到最大值。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)、酶解溫度的升高，總糖含量基本不變。隨著酶解pH的升高，總酸及總糖含量均呈降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH為5.5時(shí)，總酸、總糖含量最高，這說(shuō)明較低酶解pH更利于紫貽貝肉中各種酸和糖的釋放。

2.1.2 酶解條件對(duì)酶解液中三甲胺含量的影響 三甲胺可與組織中的脂肪共同作用產(chǎn)生腥味，且呈味閾值較低，從而對(duì)酶解液的風(fēng)味產(chǎn)生一定的影響［14］。由圖2可知，隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，紫貽貝酶解液中三甲胺含量呈逐漸上升的趨勢(shì)，酶解時(shí)間超過(guò)1h后，三甲胺含量的增加趨緩。隨著酶解溫度、酶解pH的升高，酶解液中三甲胺含量均呈先升高后降低的趨勢(shì)，在酶解溫度為50℃、pH為6.0時(shí)，三甲胺含量達(dá)到最大值。同時(shí)由圖2可知，紫貽貝酶解液中三甲胺含量低于1.2mg/100g。而在新鮮魚(yú)中，三甲胺可接受的最大量為10～15mg/100g［9］。因此紫貽貝酶解液中三甲胺含量在可接受范圍之內(nèi)，其腥味不影響酶解液的整體風(fēng)味。

圖2 酶解條件對(duì)紫貽貝酶解液中三甲胺含量的影響Figure 2 Effect of enzymatic conditions on TMA content of Mytilus edulis enzymolysate

2.1.3 酶解條件對(duì)酶解液肽分子量分布的影響 由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，分子量≥10kDa的肽比例降低，分子量5～10kDa的肽比例無(wú)明顯變化，分子量1～5kDa的肽比例先升高后趨緩，分子量＜1kDa的肽比例不斷升高。這說(shuō)明酶解過(guò)程中，肽逐漸分子量逐漸降低。隨著酶解溫度的升高，分子量＜1kDa的肽比例呈先上升后下降的趨勢(shì)，而1～5kDa、分子量≥10kDa的肽比例均呈先下降后上升的趨勢(shì)，5～10kDa的肽比例無(wú)明顯變化。隨著酶解pH的升高，分子量＜1kDa的肽比例降低，分子量1～10kDa的肽比例先升高后降低，分子量≥10kDa的肽比例升高。這說(shuō)明pH較低時(shí)，有利于低分子量肽的生成。酶解過(guò)程中產(chǎn)生的肽類(lèi)物質(zhì)對(duì)酶解液風(fēng)味的影響，主要是部分寡肽與其他呈味物質(zhì)發(fā)生相乘作用，使酶解液風(fēng)味飽滿、口感協(xié)調(diào)［15］。紫貽貝酶解液中的呈味肽，很可能是分子量較低的肽。

圖3 不同酶解條件下紫貽貝酶解液中肽分子量的分布Figure 3 Effect of enzymatic conditions on molecular weight distribution of peptide in Mytilus edulis enzymolysate

2.1.4 酶解過(guò)程中氨基酸的釋放 酶解過(guò)程中，紫貽貝蛋白逐漸被水解成小分子肽和游離氨基酸。酶解液中的肽類(lèi)具有復(fù)雜的呈味功能，其中鮮味肽、苦味肽、甜味肽能夠賦予酶解液協(xié)調(diào)、細(xì)膩、醇厚濃郁的整體味感；游離氨基酸主要包括鮮味氨基酸（谷氨酸、天門(mén)冬氨酸）、甜味氨基酸（蘇氨酸、丙氨酸、甘氨酸等）、苦味氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等），呈味氨基酸的含量和比例也是影響酶解液風(fēng)味的重要因素之一。

紫貽貝酶解液中，氨基酸主要有兩種類(lèi)型：① 游離氨基酸；② 仍存在于未被水解的肽中。由圖4可知，隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中氨基酸種類(lèi)不發(fā)生變化，但釋放的總氨基酸、游離氨基酸、肽含量變化明顯。與未經(jīng)酶解的樣品相比，酶解后的樣品中總氨基酸、游離氨基酸、肽基氨基酸含量明顯升高，且所有氨基酸的含量均迅速增加。酶解1h樣品的總氨基酸、游離氨基酸、肽基氨基酸含量分別為是11.190，4.798，6.389mg/mL，比酶解前氨基酸總量分別增加了276.8%，229.5%，321.9%。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基酸總量增加速度減緩，酶解2h后，總氨基酸、游離氨基酸總量增加緩慢，肽基氨基酸含量開(kāi)始降低。

隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮味氨基酸、甜味氨基酸及苦味氨基酸含量均明顯提高。其中，大部分苦味氨基酸及甜味氨基酸的含量低于其呈味閾值，因此其含量的增加基本不影響酶解液的苦味和甜味；鮮味氨基酸含量與其呈味閾值接近，并能與鹽、有機(jī)酸發(fā)生相乘作用而明顯增加酶解液的鮮味［15］。鮮味肽、甜味肽、苦味肽含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。

圖4 不同酶解時(shí)間后紫貽貝酶解液的氨基酸組成和含量Figure 4 Effect of enzymatic time on the composition and content of amino acids in Mytilus edulis enzymolysate

綜合比較紫貽貝酶解液的肽得率、肽分子量分布、氨基酸分析結(jié)果可知，不同酶解條件下制備的酶解液中，分子量＜1kDa的肽均占較大比例，且隨著酶解條件的變化，肽得率、肽基呈味氨基酸含量變化趨勢(shì)大致相同。趙謀明等［4］指出，分子量＜1kDa的肽具有特殊的呈味特性。由此推測(cè)，紫貽貝酶解液中具有海鮮特征風(fēng)味的呈味肽，大部分是分子量＜1kDa的肽。酶解條件為2.0h、50℃、pH 6.5時(shí)，紫貽貝酶解液的肽得率、水解度和低分子量肽的比例較高，呈味物質(zhì)和氨基酸的釋放較充分。在此條件下大量制備紫貽貝酶解液，進(jìn)行風(fēng)味肽的分離純化。

2.2 紫貽貝酶解液中海鮮風(fēng)味肽的分離純化

2.2.1 紫貽貝海鮮風(fēng)味肽的超濾分離 超濾膜可將紫貽貝酶解液中的肽與蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)進(jìn)行分離，同時(shí)將海鮮風(fēng)味肽與其他分子量的肽進(jìn)行分離［1］。由圖5可知，與其他分子量肽段相比，酶解原液的鮮味最低、苦味最高。超濾可明顯提升酶解液的風(fēng)味，使鮮味評(píng)分升高，苦味評(píng)分降低。鮮味值隨著截留分子量的減少而呈逐漸增大的趨勢(shì)，其中1 kDa濾膜透過(guò)液的鮮味值最高，且相對(duì)原酶解液有顯著提高。苦味值隨截留分子量的減少而呈逐漸減小的趨勢(shì)，其中，10kDa超濾膜對(duì)于酶解液超濾祛苦的效果最明顯，而1kDa濾膜透過(guò)液的苦味值最低，且明顯低于原酶解液。這可能是由于酶解液中引起苦味的疏水性短肽分子量較大，截留分子量逐級(jí)減小的超濾膜可以將它們有效去除。與此同時(shí)，逐級(jí)超濾對(duì)鮮味物質(zhì)起到了一定的濃縮作用，使得超濾液的鮮味值逐漸升高［14］。

圖5 各級(jí)濾膜透過(guò)液的風(fēng)味分析Figure 5 Flavor analysis of Mytilus edulis enzymolysate under various ultrafiltration conditions

超濾液的風(fēng)味分析結(jié)果表明，鮮味肽大量存在于1kDa濾膜透過(guò)液中，這證實(shí)了海鮮風(fēng)味肽是分子量＜1kDa的肽這一推測(cè)。這與伍彬等［6］的研究結(jié)果一致。由于1kDa濾膜透過(guò)液與3kDa濾膜透過(guò)液的風(fēng)味相差較小，綜合鮮味和苦味的評(píng)分，大量制備3kDa濾膜透過(guò)液用作下一步分離純化。

2.2.2 紫貽貝海鮮風(fēng)味肽的凝膠柱層析分離 由圖6可知，3kDa濾膜透過(guò)液在洗脫時(shí)得到4個(gè)峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，其中峰－Ⅱ的風(fēng)味最佳，鮮味濃郁、苦味極低；而峰－Ⅰ、峰－Ⅲ和峰－Ⅳ的鮮味不明顯，且苦味較高。故對(duì)峰－Ⅱ進(jìn)行大量收集，用于反相高效液相色譜分析。

2.2.3 紫貽貝海鮮風(fēng)味肽的反相高效液相色譜分析 由圖7可知，經(jīng)反相高效液相色譜分析后，峰－Ⅱ組分仍然包括3個(gè)樣品峰-V、峰-VI、峰-VII，峰-VI和峰-VII在220nm和280 nm處的強(qiáng)度均明顯低于峰-V。經(jīng)風(fēng)味分析可知，峰-V的鮮味值為4.8，明顯高于峰-VI和峰-VII（2.0和1.5），故選取峰-V進(jìn)行收集，用于紫貽貝海鮮風(fēng)味肽的結(jié)構(gòu)鑒定及構(gòu)效分析。

2.2.4 UHR—Q—TOF質(zhì)譜分析紫貽貝海鮮風(fēng)味肽峰-V的氨基酸序列 圖8是紫貽貝風(fēng)味肽峰-V的一級(jí)質(zhì)譜圖，其中主要包含質(zhì)荷比分別為340.760 5，679.510 3，701.492 4的3種組分。3種組分為同一種物質(zhì)的3種不同表現(xiàn)形式，其中340.760 5是帶2個(gè)電荷的，679.510 3是單電荷形式的，701.492 4 是 ［M＋Na］峰，因 此，只 需 對(duì) 質(zhì) 荷 比為679.510 3的這個(gè)肽鏈進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。根據(jù)氨基酸平均分子量128可推斷，峰-V的組分是由5至6個(gè)氨基酸組成的寡肽。伍彬［6］、王娟［16］的研究也表明，凡納濱對(duì)蝦蝦頭自溶產(chǎn)物、金華火腿中的鮮味肽均為寡肽。

圖6 3kDa濾膜透過(guò)液的Sephadex G-25凝膠柱層析和風(fēng)味分析圖Figure 6 Sephadex G-25gel chromatograms and flavor analysis of Mytilus edulis enzymolysate under 3kDa ultrafiltration conditions

圖7 紫貽貝風(fēng)味肽組分峰－Ⅱ和溶劑峰的反相高效液相色譜圖Figure 7 Reversed phase high performance liquid chromatography of peak-Ⅱand solvent blank from Mytilus edulis seafood flavor peptides

圖8 紫貽貝風(fēng)味肽組分峰-V的一級(jí)質(zhì)譜圖Figure 8 Mass spectrum of peak V from Mytilus edulis seafood flavor peptides

圖9為母離子m/z＝679.510 3的二級(jí)質(zhì)譜圖。母離子m/z＝679.510 3經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離（CID）后，可能產(chǎn)生3種類(lèi)型的碎片離子，包括序列離子、中間碎片離子和衛(wèi)星離子。但是在CID的裂解能量不高時(shí)，肽鏈中的肽鍵（酰胺鍵）更易發(fā)生斷裂，從而更易產(chǎn)生b型離子和y型離子。結(jié)合紫貽貝海鮮風(fēng)味肽的氨基酸分析結(jié)果，采用從頭測(cè)序（de novo）的方法對(duì)未知肽段進(jìn)行氨基酸序列分析可知，其氨基酸序列為CSVQDQ 或 QAVNFT，即Cys-Ser-Val-Gln-Asp-Gln或 Gln－Ala-Val-Asn-Phe-Thr。經(jīng)計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量理論值分別為121＋105＋117＋146＋133＋146－18×5＝679－1和146＋89＋117＋132＋165＋119－18×5＝679－1，與質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果一致。

Glu、Gln、Asp、Asn之間相互結(jié)合形成的短肽或它們與Gly、Ala、Met、Thr、Ser、Cys相互結(jié)合形成的多元酸鈉鹽可以呈現(xiàn)較為明顯的鮮味特征［17］。Cerny等［18］發(fā)現(xiàn)含有Glu或Asp的肽與一定濃度的鹽或味精等呈味成分有較強(qiáng)的協(xié)同增鮮功能。研究發(fā)現(xiàn)，部分游離氨基酸具有一定的鮮味特征，但其呈鮮味的特性遠(yuǎn)低于鮮味肽，這是由于氨基酸通過(guò)肽鍵的連接后，相互作用明顯增強(qiáng)，從而使鮮味特性顯著提高［1，2，17］。本研 究 分 離 純 化 出 的 六 肽 Cys-Ser-Val-Gln-Asp－Gln或 Gln-Ala-Val-Asn-Phe-Thr含有以上特征氨基酸，但氨基酸序列獨(dú)特，不同于任何目前已知序列的呈味肽。

圖9 紫貽貝風(fēng)味肽組分峰-V一級(jí)質(zhì)譜中核質(zhì)比為的679.510 3母離子二級(jí)質(zhì)譜圖Figure 9 MS/MS spectrum of the precursor ion with m/zof 679.510 3from MS of peak V from Mytilus edulis seafood flavor peptides

根據(jù)TDA法分析得到紫貽貝海鮮風(fēng)味肽峰-V的呈味閾值為0.1mg/mL，明顯低于谷氨酸一鈉（味精，MSG）的呈味閾值（0.3mg/mL）［19］。

3 結(jié)論

紫貽貝酶解過(guò)程中，總酸、總糖、三甲胺、多肽、氨基酸等含量的變化均遵循一定規(guī)律，其共同作用決定了酶解液的風(fēng)味特征。海鮮風(fēng)味肽為低分子量肽，pH較低的條件利于其生成。這為水產(chǎn)蛋白，尤其是貝類(lèi)蛋白酶解過(guò)程中呈味物質(zhì)釋放規(guī)律的研究提供了理論參考。經(jīng)超濾、凝膠層析和反相高效液相色譜分離純化得到的呈味肽純度較高，此方法適用于海鮮風(fēng)味肽的分離純化。海鮮風(fēng)味肽的結(jié)構(gòu)為Cys-Ser-Val-Gln-Asp-Gln或 Gln-Ala-Val-Asn-Phe-Thr，不同于任何目前已知序列的呈味肽。其呈味閾值明顯低于MSG，作為鮮味劑，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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