劉繼超 陳柏儒 姜鐵民 陳歷?。?北京三元食品股份有限公司，北京 0063；.北京市育才學(xué)校，北京 00050）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA），是目前最常見的能夠引起細(xì)菌性食物中毒的病原體之一，該菌產(chǎn)生葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）是引起食物中毒的主要原因。根據(jù)血清學(xué)特性，SEs可分為5型（SEA、SEB、SEC、SED、SEE），這五類稱為經(jīng)典腸毒素，也是全球食物中毒中最常見的血清型［1，2］，其中引起的食物中毒最多的是A和D型，B和C型次之。

目前檢測金黃色葡萄球菌腸毒素的主要方法是免疫學(xué)方法，其特異性和靈敏度較差，已不能滿足食物中毒等公共安全事件檢測的需要［3］。但隨著PCR技術(shù)的完善，應(yīng)用該技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌腸毒素的報(bào)道［4－6］越來越多。顧琳等［7］使用PCR技術(shù)檢測出食品中金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、G等，其中SEA的檢出率最高為77.27%。Mehrotra等［8］使用多重PCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、D、E的基因，比用單一引物更具特異性和有效性。而簡并引物有比特異引物有更高的適應(yīng)性［9］，以及較寬的檢測范圍，這對提高檢測效率和降低檢測成本更為有利。本研究擬利用SEA與SEB之間具有同源性的特點(diǎn)，自行設(shè)計(jì)簡并引物SEAB，在同一臺(tái)PCR儀、同一PCR條件下，建立同時(shí)檢測SEA、SEB的方法，不僅能夠克服酶聯(lián)免疫法檢測時(shí)間長的問題，還可提高PCR技術(shù)的檢測效率，降低檢測成本，對于快速診斷是否是由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

PCR儀：GeneAmp PCR System 2400型，美國PE公司；

電泳儀：PAC300型，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；

天能凝膠成像儀：Tanon GIS 2010型，上海天能科技有限公司；

離心機(jī)：2K15型，美國Sigma公司。

1.1.2 試劑

乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、無水乙醇、苯酚、三氯甲烷、異戊醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

胞壁質(zhì)酶：超純，10kU/mg，美國Sigma公司；

核糖核酸酶A：≥50kU/mg，美國Sigma公司；

瓊脂糖：優(yōu)級(jí)純，Spain Agarose香港基因公司；

dNTPs、PCR染料、DNA Marker B：超純，北京賽百盛基因技術(shù)公司；

Taq DNA聚合酶：5U/μL，北京賽百盛基因技術(shù)公司；

PCR產(chǎn)物回收試劑盒（離心柱型）、新型pUM－T快速克隆試劑盒：北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 菌種

金黃色葡萄球菌腸毒素SEA（ATCC－13565）、金黃色葡萄球菌腸毒素SEB（ATCC－14458）：中國藥品生物制品檢定所菌種保藏中心；

金黃色葡萄球菌（CGMCC1.0128）、大腸桿菌（CGMCC1.1369）、沙門氏菌（CGMCC1.1552）、表皮葡萄球菌（CGMCC1.2429）：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板提取 挑取金黃色葡萄球菌腸毒素SEA和SEB的菌落，分別接種于10mL營養(yǎng)肉湯中，放置與37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h后，培養(yǎng)基中有大量菌體增殖，分別離心收集菌體，提取基因組 DNA［3，10］，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 擴(kuò)增引物設(shè)計(jì) 依據(jù)http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/上發(fā)布的SEA和SEB的基因編碼序列，利用生物軟件ClustalW與Primer 5.0，設(shè)計(jì)檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A和B的簡并引物SEAB（見表1），簡并引物SEAB在SEA和SEB上的相應(yīng)位置分別為566～670，338～472，擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為105，135bp。

表1 引物SEAB的序列Table 1Primers sequence of SEAB

1.2.3 配制PCR反應(yīng)體系 PCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌腸毒素SEA和SEB的反應(yīng)體系為20μL：模板1μL、上下游引物各0.5μL（25μmol/L）、10×擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液2μL、PCR染料2μL、dNTPs 0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，其余為無菌超純水。離心混勻后置PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，循環(huán)參數(shù)設(shè)置：預(yù)變性95℃3min，變性95℃30s→退火51℃30s→延伸72℃1min，循環(huán)數(shù)為30，最后72℃延伸10min。從上述反應(yīng)體系中吸取10μL，用于電泳檢測。

1.2.4 克隆及測序 吸取PCR擴(kuò)增后反應(yīng)體系100μL，按PCR產(chǎn)物回收試劑盒的說明書操作。菌液抽提陽性質(zhì)粒，送至天根科技公司進(jìn)行測序。

1.2.5 特異性分析 利用上述PCR檢測方法同時(shí)擴(kuò)增SEA菌株、SEB菌株和對照菌株的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌基因組DNA，然后電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，判定簡并引物的特異性。

1.2.6 靈敏度分析 將提取的模板DNA進(jìn)行適量稀釋，再使用紫外分光光度計(jì)測定260nm波長下的OD值，按式（1）計(jì)算其濃度。然后將其按照10倍系列進(jìn)行逐步稀釋至10－5，以此為模板進(jìn)行PCR檢測，以分析簡并引物SEAB檢測SEB的DNA靈敏度。

式中：

c——DNA濃度，μg/mL；

m——50μg/mL，OD260＝1 時(shí) dsDNA 濃 度 約 為50μg/mL；

n——模板稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果

將測序的結(jié)果在NCBI的Blast上與GenBank中核苷酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與GenBank上發(fā)布的SEA和SEB基因序列的同源性均達(dá)到99%（見圖1、2），證明了擴(kuò)增的目的產(chǎn)物分別為SEA、SEB基因。

圖1 SEA的Blast比對結(jié)果Figure 1 Blast comparison results of SEA

圖2 SEB的Blast比對結(jié)果Figure 2 Blast comparison results of SEB

2.2 簡并引物SEAB特異性分析

在同一個(gè)反應(yīng)體系中分別加入SEA、SEB菌的DNA模板1μL，無菌超純水12μL，其余用量與反應(yīng)條件均同1.2.3，電泳檢測的結(jié)果見圖3、4。由圖3、4可知，PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增出SEA和SEB菌的目的基因片段，而對照組未出現(xiàn)特異性片段，顯示出良好的特異性，且整個(gè)檢測過程不超過20h，說明簡并引物SEAB可以在同一個(gè)反應(yīng)體系與反應(yīng)條件下同步檢測產(chǎn)SEA和SEB的金黃色葡萄球菌。

圖3 SEA、SEB在同一個(gè)PCR反應(yīng)管中反應(yīng)的電泳分析圖Figure 3 Electrophoretic analysis of SEA and SEB in the same PCR reaction tube

圖4 簡并引物SEAB特異性的瓊脂糖凝膠電泳分析圖Figure 4 Electrophoretic analysis the specificity of SEAB with degenerate primers

2.3 簡并引物SEAB靈敏性分析

紫外分光光度計(jì)分別測定SEB的DNA模板的OD260＝0.716 0，得出DNA含量為358ng/μL，分別吸取各稀釋倍數(shù)的DNA模板1μL，進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果見圖5。由圖5可知，DNA靈敏度為3.58ng。

圖5 簡并引物SEAB靈敏性的瓊脂糖凝膠電泳分析圖Figure 5 Electrophoretic analysis the sensitivity of SEAB with degenerate primers

3 結(jié)論

本研究通過對SEA、SEB設(shè)計(jì)簡并引物SEAB建立了能夠準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增目的基因的PCR方法，即一次PCR反應(yīng)可同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)靶基因，表現(xiàn)出了良好的特異性，能夠有效區(qū)分其它引起食物中毒的病原菌，SEB的DNA最低檢測濃度為3.58ng，整個(gè)檢測過程不超過20h，不但節(jié)省了檢測時(shí)間，降低了檢測成本，減少了漏檢的可能性，而且為金黃色葡萄球菌腸毒素SEA和SEB菌引起的食物中毒事件快速篩查，以及流行病學(xué)研究提供了一種快速準(zhǔn)確的檢測方法。

在PCR反應(yīng)中，若簡并引物的簡并度過高，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增效率和特異性較差，會(huì)嚴(yán)重影響目的片段的分離，應(yīng)適當(dāng)增加引物的濃度和調(diào)整退火溫度，才能獲得理想的檢測效果［11］。而本研究設(shè)計(jì)的簡并引物的簡并度較低為32，不增加引物濃度或降低退火溫度同樣可獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果。此外也應(yīng)注意，在設(shè)計(jì)簡并引物時(shí)，由于簡并度的增加，PCR的特異性會(huì)下降，可能會(huì)造成假陽性結(jié)果。因此，探討如何降低簡并引物的簡并度，提高簡并引物的PCR擴(kuò)增效率和特異性對于成功應(yīng)用簡并引物PCR法具有重要意義，例如用脫氧次黃苷（dI）替代簡并引物中的高簡并位點(diǎn)，可大幅度降低簡并程度，顯著提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性及擴(kuò)增效率。

1 何暉，劉華章，魏泉德.PCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、E基因的研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（7）：1 585～1 587.

2 Smyth Davida S，Hartigan Patrick J，Meaney William J，et al.Superantigen genes encoded by the egc cluster and SaPIbov are predominant amongStaphylococcus aureusisolates from cows，goats，sheep，rabbits and poultry［J］.Journal of Medical Microbiology，2005，54（4）：401～411.

3 劉繼超，姜鐵民，姜阿赤.多重PCR檢測金黃色葡萄球菌六型腸毒素基因的研究［J］.食品科技，2012，37（6）：304～307.

4 Gigaud O.Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France［J］.Int.J.Food Microbiol.，2002，77（1～2）：61～70.

5 Lovseth A，Loncarevic S，Berdal K G.Modified multiplex PCR method for detection of pyrogenic exotoxin genes in staphylococcal isolates［J］.J.Clin Microbiol.，2004，42（8）：3 869～3 872.

6 Ikeda T，Tamate N，Yamaguchi K，et al.Quantitative analysis ofStaphylococcus aureusin skimmed milk powder by real－time PCR［J］.J.Vet.Med.Sci.，2005，67（10）：1 037～1 041.

7 顧琳，黃平，宋衍燕，等.PCR檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素基因［J］.中國食物與營養(yǎng)，2015，21（2）：17～19.

8 Mehrotra M，Wang G，Johnson W M.Multiplex PCR for detection of genes for Staphylococcus aureusenterotoxins，exfoliative toxins，toxic shock syndrome toxin 1，and methicllin resistance［J］.Journal of Clinical Microbiology，2000，38（3）：1 032～1 035.

9 王少峽，陳麗媛，張競秋，等.利用生物信息學(xué)資源設(shè)計(jì)簡并引物［J］.天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，26（2）：26～29.

10 Moon J S，Lee A R，Kang H M，et al.Antibiogram and coagulase diversity in staphylococcal enterotoxin－producingStaphylococcus aureusfrom bovine mastitis［J］.Journal of Dairy Science，2007，90（4）：1 716～1 724.

11 Simon A L，Jean M D，Johan M，et al.Identification of potyviruses using the polymerase chain reaction with degenerate primers［J］.Journal of General Virology，1991（73）：1 531～1 541.