王海潮 張興桃 董 增 吳 蕭（.宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000；2.宿州學(xué)院特色種植業(yè)苗種生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，安徽 宿州 234000）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）屬甲殼綱、十足目、方蟹科，又稱河蟹，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種經(jīng)濟(jì)蟹類，是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴水產(chǎn)品之一［1］。近年來(lái)，河蟹日益嚴(yán)重的病害問(wèn)題已成為養(yǎng)蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要阻礙因素之一。在蟹類疾病防治中，抗菌藥物發(fā)揮著重要作用，但由于病原微生物的耐藥性和機(jī)體藥物殘留等問(wèn)題，部分藥物使用已受到了嚴(yán)格的限制。因此，研究抗菌藥物對(duì)機(jī)體的免疫影響來(lái)指導(dǎo)用藥就具有十分重要的意義。

喹諾酮類（quinolones）藥物具有廣譜、高效、低殘留、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，是常用的臨床抗菌藥物，也是魚病防治上公認(rèn)的理想抗菌藥物［2－4］，目前水產(chǎn)上常用的喹諾酮類藥物主要有諾氟沙星、氧氟沙星和恩諾沙星等。范紅結(jié)等［5］報(bào)道恩諾沙星對(duì)中華絨螯蟹的雷氏普羅威登菌（Providenciarettgeri）敏感度很高；張雅斌等［6］用恩諾沙星對(duì)細(xì)菌性敗血病等5種諾酮類藥物幾乎對(duì)水生動(dòng)物所有病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌作用。喹諾酮類藥物對(duì)淡水養(yǎng)殖魚類常見病的病原菌均有較強(qiáng)的抑菌作用；但大量試驗(yàn)［7－10］證明喹諾酮類藥物可引發(fā)消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)肝腎功能等臟器損害及過(guò)敏等不良反應(yīng)。近年來(lái)，為系統(tǒng)評(píng)價(jià)甲殼動(dòng)物的免疫水平，研究人員［11－14］先后采用了各種血清酶指標(biāo)，其中應(yīng)用較多的有酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、堿性磷酸酶（ALP）、溶菌酶 （LSZ）等。研究［15－17］表明喹諾酮類藥物可影響動(dòng)物免疫力，在低劑量時(shí)還對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有促進(jìn)作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，增進(jìn)機(jī)體對(duì)病原體的吞噬力；鞏華等［18］通過(guò)投喂恩諾沙星對(duì)鯉魚血清酶的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度藥物（1g/kg）對(duì)鯉魚肝、腎有明顯影響。關(guān)于抗生素對(duì)免疫的影響，除產(chǎn)生免疫抑制外，近年來(lái)對(duì)部分抗生素的免疫促進(jìn)作用有較多報(bào)道［19］。張麗敏等［20］報(bào)道恩諾沙星以20mg/kg腹腔注射紅笛鯛，可明顯提高紅笛鯛血清中抗體IgM的含量，這種作用可持續(xù)3周左右，表明恩諾沙星對(duì)魚類體液免疫有良好的促進(jìn)作用。王海潮等［21］研究過(guò)常用抗菌藥物對(duì)鋸緣青蟹體外血清酚氧化酶的影響，但喹諾酮類藥物對(duì)中華絨螯蟹的體內(nèi)血清酶的免疫影響未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬以中華絨螯蟹為試驗(yàn)對(duì)象，研究3種喹諾酮類藥物諾氟沙星、氧氟沙星和恩諾沙星對(duì)中華絨螯蟹血清酚氧化酶（PO）、過(guò)氧化物酶（POD）、堿性磷酸酶（ALP）、溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）等活力指標(biāo)的影響，旨在為中華絨螯蟹養(yǎng)殖生產(chǎn)中合理用藥提供科學(xué)依據(jù)，并為進(jìn)一步研究漁用藥物的作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

中華絨螯蟹：體質(zhì)量為（150±30）g，安徽宿州某養(yǎng)殖場(chǎng)提供。選擇體色好、步足健全、無(wú)外傷的個(gè)體，隨機(jī)分成4組，每組18只，暫養(yǎng)于48cm×37cm×29cm塑料箱中，試驗(yàn)期間水溫（23±2）℃，鹽度19.5‰。

1.2 儀器與試劑

酶標(biāo)儀：VersaMax型，美國(guó) Molecular Devices Corporation（MDC）公司；

可見分光光度計(jì)：751型，上海分析儀器廠；

3，4－二 羥 苯 丙 氨 酸 （L－3，4－dihydroxyp henylalamine，L－DOPA）：分析純，美國(guó)Sigma公司；

溶壁微球菌AS1.635（Micrococcus lysoleikticusAS1.635）凍干粉：生物試劑，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心；

抗菌藥諾氟沙星、氧氟沙星和恩諾沙星：針劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為99%，東北制藥廠（GMP獸藥認(rèn)證公司）；

SOD、AST和ALT測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；

其余試劑：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抗菌藥物的注射 取注射用無(wú)菌諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星針劑，用無(wú)菌生理鹽水稀釋到3.75mg/mL。酒精棉球消毒中華絨螯蟹步足基部后，注射約0.2mL藥液，使中華絨螯蟹注射量為5mg/kg體質(zhì)量（為常規(guī)疾病治療劑量）。每組注射18只中華絨螯蟹，對(duì)照組注射無(wú)菌生理鹽水。

1.3.2 血清的制備 注射藥液組分別于注射后6，12，24，48，72，96h隨機(jī)取6只中華絨螯蟹，抽取血淋巴（在第四步足與背面交界處），在4℃下以8 000r/min離心5min，吸取上清液，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 酚氧化酶（PO）活力的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［22］修改如下：在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)孔中加入0.2mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液（PB）170μL，10μL注射抗菌藥物的待測(cè)中華絨螯蟹血清，充分混合后37℃保溫15min，再加入0.6mg/mL L－DOPA 20μL，立即放入 MD VersaMax酶標(biāo)儀中，振蕩混勻后，每隔5min讀取490nm處吸光值，反應(yīng)15min；以每分鐘OD490增加0.001作為1個(gè)酶活力單位（U）。對(duì)照組用生理鹽水。

在江漢油田涪陵頁(yè)巖氣公司，有個(gè)爆紅的“小米現(xiàn)象”—頁(yè)巖氣公司技術(shù)中心的技術(shù)員們來(lái)的最早、走的最晚，辦公樓幾乎夜夜燈火通明。而這個(gè)現(xiàn)象起源于技術(shù)員米瑛……

1.3.4 過(guò)氧化物酶（POD）活力的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［23］修改如下：以鄰苯二胺為底物，在96孔酶標(biāo)板中加入20μL血清，再加入180μL顯色緩沖液（C6H8O7·H2O 7.3g，Na2HPO4·2H2O 11.86g，雙蒸水定容至1 000mL），置于酶標(biāo)儀中，測(cè)490nm處的OD值（A3）；向樣品中加入鄰苯二胺4mg，30%H2O24μL，10mL顯色緩沖液配置的顯色液20μL，待搖勻后，顯色15min，測(cè)490nm處的OD值（A4）。POD相對(duì)活力以APOD＝A4－A3表示。

1.3.5 堿性磷酸酶（ALP）活力的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［24］修改如下：取血清200μL，加入800μL pH 8.8的Tris—HCl緩沖液（加入Tris堿121.1g，濃鹽酸70mL，用雙蒸水定容到1 000mL），于37℃水浴10min，然后加入5mmol/L的底物50μL，反應(yīng)10min，加入0.1mol/L NaOH 溶液4mL終止反應(yīng)，生成的對(duì)硝基酚在400nm處測(cè)定。空白是將血清換為雙蒸水。以每分鐘吸光值上升0.01為一個(gè)活力單位。

1.3.6 血清溶菌酶（LSZ）活力的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［25］修改如下：以溶壁微球菌凍干粉為底物，溶于0.1mol/L pH 6.4的磷酸鉀鹽緩沖液中，調(diào)整菌懸液的OD值（OD570＝0.3），在冰浴中加入3mL菌懸液于小試管內(nèi)，再加入50μL待測(cè)血清，混勻，立即在570nm下測(cè)其OD值，后將試管移入37℃水浴中反應(yīng)30min，取出，迅速在冰浴中終止反應(yīng)，測(cè)其OD值。溶菌活力按式（1）計(jì)算：

式中：

U——血清溶菌酶（LSZ）活力，U；

A1——待測(cè)血清反應(yīng)前的OD值；

A2——待測(cè)血清反應(yīng)后的OD值。

1.3.7 其他酶指標(biāo)的活力測(cè)定 血清超氧化物岐化酶（SOD）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活力的測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒，按試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。上述測(cè)定均用751分光光度計(jì)進(jìn)行讀數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，用SPSS（statiscal package for the social science）13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，當(dāng)差異顯著（P＜0.05）時(shí)，用LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行均值間多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 喹諾酮類對(duì)酚氧化酶（PO）活力的影響

注射諾氟沙星等3種喹諾酮類抗菌藥后，中華絨螯蟹體內(nèi)PO活力在短期內(nèi)出現(xiàn)上升，在6～12h達(dá)到最大值，此后逐漸減??；注射生理鹽水的對(duì)照組PO活力基本穩(wěn)定，后期酶活力略有下降；恩諾沙星對(duì)PO的活力增高最為明顯，6h時(shí)的PO活力較對(duì)照組升高73.44%，差異極顯著（P＜0.01）；96h后，PO活力下降至與對(duì)照組基本相同。上述結(jié)果初步表明，3種藥物注射后可使中華絨螯蟹的PO活力得到提高，其中以恩諾沙星的影響最為明顯（圖1）。王海潮等［16］研究喹諾酮類抗菌藥物對(duì)鋸緣青蟹PO的體外試驗(yàn)表明，低濃度時(shí)表現(xiàn)為增強(qiáng)作用，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖1 喹諾酮類藥物對(duì)中華絨螯蟹血清PO活力的影響Figure 1 Effects of quinolones on the PO activity of serum of Eriocheir sinensis

2.2 喹諾酮類對(duì)過(guò)氧化物酶（POD）活力的影響

由圖2可知，中華絨螯蟹體內(nèi)POD活力在短期內(nèi)出現(xiàn)上升，在6～12h達(dá)到最大值，此后逐漸減?。蛔⑸潲}水的對(duì)照組POD活力基本穩(wěn)定，后期酶活力略有下降；POD活力在6～12h時(shí)達(dá)最大值，諾氟沙星、氧氟沙星和恩諾沙星組的POD活力分別比對(duì)照組升高34.53%，26.62%，39.18%，差異顯著（P＜0.05）；96h后，POD活力下降至與對(duì)照組基本相同。3種藥物注射后可使中華絨螯蟹POD活力得到提高，其中以恩諾沙星的影響最為明顯。過(guò)氧化物酶是一類含輔基鐵卟啉的酶類，主要作用為清除細(xì)胞生理代謝過(guò)程中的活性氧，減少其對(duì)正常細(xì)胞的損傷，提高機(jī)體的解毒免疫功能和防病抗病能力［14］，是機(jī)體解毒免疫功能和防病抗病能力的重要指標(biāo)之一。本試驗(yàn)POD活力增加，表明喹諾酮類藥物可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能和抗病能力。

圖2 喹諾酮類藥物對(duì)中華絨螯蟹血清POD活力的影響Figure 2 Effects of quinolones on the POD activity of serum of Eriocheir sinensis

2.3 喹諾酮類對(duì)堿性磷酸酶（ALP）的影響

中華絨螯蟹注射藥物后，短期內(nèi)ALP活力有明顯升高，ALP活力在48h升至較高水平，與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05）；隨后逐漸降低，至96h時(shí)注射不同藥物組ALP降至與對(duì)照相同水平，對(duì)照組酶活力未出現(xiàn)相應(yīng)變化。結(jié)果表明：中華絨螯蟹注射藥物后ALP活力升高，3種抗菌藥物對(duì)中華絨螯蟹ALP的影響程度為恩諾沙星＞諾氟沙星＞氧氟沙星（圖3）。堿性磷酸酶可修飾改變細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)使其更易為機(jī)體識(shí)別，加快免疫系統(tǒng)對(duì)異物的識(shí)別、吞噬和清除，為免疫的常規(guī)指標(biāo)酶類之一。ALP活力明顯升高，表明免疫系統(tǒng)對(duì)異物識(shí)別的結(jié)果。

圖3 喹諾酮類藥物對(duì)中華絨螯蟹血清ALP活力的影響Figure 3 Effects of quinolones on the ALP activity of serum of Eriocheir sinensis

2.4 喹諾酮類對(duì)溶菌（LSZ）活力的影響

注射后，可出現(xiàn)血清溶菌活力升高，溶菌活力在24h時(shí)升至最大值，比對(duì)照組溶菌酶活力提高44.27%～79.56%，呈顯著差異（P＜0.05），隨后下降，96h降至與對(duì)照組相同水平，對(duì)照組整個(gè)試驗(yàn)期間溶菌水平無(wú)明顯變化（圖4）。表明注射藥物可使中華絨螯蟹血清溶菌水平提高，以恩諾沙星最為明顯，其次依次為諾氟沙星和氧氟沙星。溶菌酶是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，在機(jī)體防御中起重要的作用［26］，是甲殼動(dòng)物重要的體液非特異性免疫因子。多種免疫增強(qiáng)劑可增強(qiáng)甲殼動(dòng)物溶菌酶活力，提高機(jī)體抗病能力［14］。本試驗(yàn)注射喹諾酮類藥物后，出現(xiàn)血清溶菌活力升高，證實(shí)可以提高機(jī)體抗病能力。

2.5 喹諾酮類對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）的影響

圖4 喹諾酮類藥物對(duì)中華絨螯蟹血清LSZ活力的影響Figure 4 Effects of quinolones on the LSZ activity of serum of Eriocheir sinensis

注射藥物后，短期內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活力有明顯升高，SOD活力在6～12h時(shí)升至較高水平，與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05）；隨后逐漸降低，至96h時(shí)注射不同藥物組的SOD降至與對(duì)照相同水平，對(duì)照組酶活力未出現(xiàn)相應(yīng)變化。結(jié)果表明：中華絨螯蟹注射藥物后促進(jìn)了SOD活力的升高，恩諾沙星對(duì)中華絨螯蟹的血清SOD的影響最顯著（圖5）。SOD活性與生物免疫水平密切相關(guān)，可作為機(jī)體非特異性免疫力的重要評(píng)判指標(biāo)［27］。多糖、滅活菌體、殼聚多糖、中藥等通過(guò)注射和口服方式可顯著增強(qiáng)河蟹的SOD活力［28］，與本試驗(yàn)注射藥物后SOD活力升高的結(jié)果一致。

圖5 喹諾酮類藥物對(duì)中華絨螯蟹血清SOD活力的影響Figure 5 Effects of quinolones on the SOD activity of serum of Eriocheir sinensis

2.6 喹諾酮類對(duì)中華絨螯蟹血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的影響

由圖6可知，注射藥物及生理鹽水12h內(nèi)，中華絨螯蟹血清AST活力均降低，24h后轉(zhuǎn)趨于平穩(wěn)。比較24～96h的轉(zhuǎn)氨酶水平差異，發(fā)現(xiàn)注射藥物各組的血清AST均低于對(duì)照組。血清轉(zhuǎn)氨酶水平主要用于評(píng)價(jià)臟器受損情況，存在于胞內(nèi)，是組織病變、中毒臟器大面積損傷的重要指標(biāo)，潘魯青等［29，30］研究重金屬對(duì)凡納濱對(duì)蝦和鋸緣青蟹毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cu2＋、Zn2＋和Cd2＋經(jīng)24h作用，可使凡納濱對(duì)蝦和青蟹血清轉(zhuǎn)氨酶活力升高，而肝胰腺、鰓絲和肌的酶活力隨之降低，表明相關(guān)酶隨組織損傷逸出臟器。本試驗(yàn)中血清AST均低于對(duì)照組，表明在常規(guī)使用劑量下，藥物未對(duì)中華絨螯蟹產(chǎn)生內(nèi)臟器官的明顯損傷。

圖6 喹諾酮類藥物對(duì)中華絨螯蟹血清AST活力的影響Figure 6 Effects of quinolones on the AST activity of serum of Eriocheir sinensis

2.7 喹諾酮類對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的影響

由圖7可知，注射藥物及生理鹽水12h內(nèi)，中華絨螯蟹血清ALT降低趨勢(shì)明顯，24h后轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)趨于平穩(wěn)。試驗(yàn)期間注射藥物各組血清ALT均低于對(duì)照組。表明在常規(guī)使用劑量下，藥物未對(duì)中華絨螯蟹內(nèi)臟器官產(chǎn)生明顯的損傷。本試驗(yàn)中藥物及生理鹽水注射組均出現(xiàn)了血清轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)急劇升高，隨后降低的現(xiàn)象，表明轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)可隨注射刺激出現(xiàn)較大波動(dòng)，可能與注射刺激有關(guān)。

圖7 喹諾酮類藥物對(duì)中華絨螯蟹血清ALT活力的影響Figure 7 Effects of quinolones on the ALT activity of serum of Eriocheir sinensis

3 結(jié)論

在5mg/kg肌肉注射后，中華絨螯蟹血清PO、LSZ、POD、ALP和SOD 6～24h均有不同程度的提高，但這種促進(jìn)作用不能持久，在48～96h后基本回落至與對(duì)照相同水平。對(duì)照組相關(guān)酶指標(biāo)在試驗(yàn)過(guò)程中基本保持穩(wěn)定，這種短效免疫增強(qiáng)作用的產(chǎn)生機(jī)制以及對(duì)中華絨螯蟹健康的影響，有待于今后進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，恩諾沙星對(duì)中華絨螯蟹血清PO、LSZ、POD、ALP和SOD等酶的影響均較諾氟沙星和氧氟沙星顯著，可能與恩諾沙星代謝緩慢殘留在機(jī)體時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)，相關(guān)機(jī)理正在進(jìn)一步研究之中。

對(duì)青蟹酚氧化酶體外試驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度（500μg/mL）的喹諾酮類藥物對(duì)PO有明顯抑制作用，藥物濃度為5～10μg/mL時(shí)（常規(guī)使用劑量），對(duì)青蟹PO無(wú)明顯影響。本試驗(yàn)是在體外試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以正常給藥劑量（5mg/kg）用藥，未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，表明正常用藥對(duì)機(jī)體健康影響不大，低劑量給藥，還可以提高中華絨螯蟹的免疫機(jī)能。

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