黃建蓉 王志江 李麗嫦 區(qū) 麗 徐金瑞

（廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，廣東 中山 528458）

綠豆是中國傳統(tǒng)的食用豆類作物，富含淀粉等碳水化合物。綠豆淀粉具有廣泛的用途，有研究者采用單波長法［1］或酶法［2］測定綠豆中總淀粉和直鏈淀粉含量，也有研究者［3］將雙波長法用于13種常用淀粉原料中直鏈淀粉和支鏈淀粉的同時測定，其中包括綠豆淀粉。前2種方法在進行樣品預(yù)處理時，先將淀粉從綠豆中分離出來再進行測定，后1種方法測定的樣品是從綠豆中提取出來的淀粉原料，而不是綠豆。雙波長分光光度法用于同時測定樣品中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量具有高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點，應(yīng)用日益廣泛［4－8］。需要引起注意的是，淀粉樣品的顯色條件對光度測定結(jié)果有一定影響，許多研究者［4，5，8］對此也進行了相關(guān)報道。本研究擬采用雙波長分光光度法對綠豆中直鏈淀粉和支鏈淀粉進行同時測定，樣品預(yù)處理時無需將淀粉從綠豆中分離出來，可簡化操作步驟。研究碘試劑與淀粉的顯色反應(yīng)中影響吸光度和吸光度差值測定結(jié)果的因素，并考察方法精密度和加標(biāo)回收率，對分析方法的可靠性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料

東北綠豆：深圳市永福元工貿(mào)有限公司；

金龍魚白城綠豆：原料產(chǎn)地吉林白城市，嘉里糧油（深圳）有限公司；

韶揚有機綠豆：原料產(chǎn)地遼寧朝陽，菏澤市韶揚農(nóng)產(chǎn)品有限公司。

1.1.2 試劑

直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；

石油醚、無水乙醇、碘、碘化鉀、氫氧化鈉、鹽酸：均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 儀器與設(shè)備

電子分析天平：AEY-220型，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；

雙光束紫外可見光分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；

水浴鍋：HH-zk8型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

高速萬能粉碎機：FW1000型，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 由于天然淀粉中含有的油脂具有碘值即能與碘反應(yīng)褪色，碘溶于油脂中，會使得液體呈現(xiàn)紅至橙紅色，影響顯色反應(yīng)［9］。因此，先對綠豆進行脫脂處理后再進行顯色測定。綠豆用高速萬能粉碎機粉碎并過80目篩，然后用索氏提取法進行脫脂處理，得到脫脂綠豆粉保存于干燥避光處，備用。

1.2.2 碘試劑的配制 稱取碘化鉀2.0g，溶于少量蒸餾水，再加碘0.2g，待溶解后用蒸餾水稀釋定容至100mL，即得2mg/mL的碘試劑，儲于棕色瓶中備用。

1.2.3 淀粉標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 準(zhǔn)確稱取50mg直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品，置于小燒杯中，加入1mL無水乙醇潤濕，再加入2 mol/L的氫氧化鈉溶液9mL。在90℃恒溫水浴中，分散溶解20min，用蒸餾水定容至刻度，即成1mg/mL的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備步驟同直鏈淀粉。

1.2.4 淀粉標(biāo)準(zhǔn)掃描液的制備及檢測波長的確定

（1）直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)掃描液：移取1mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50mL容量瓶中，用1mol/L和0.1mol/L的鹽酸溶液調(diào)至pH＝3，加0.5mL碘試劑，用蒸餾水定容至刻度，靜置反應(yīng)30min，以蒸餾水作參比液，上機進行波長為400～800nm的可見光波段掃描。

（2）支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)掃描液：移取4mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50mL容量瓶中，其余步驟同直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)掃描液。

（3）在同一坐標(biāo)內(nèi)繪制直鏈和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)掃描液可見光波段吸收曲線，根據(jù)作圖法確定直鏈淀粉的測定波長（λ2）和參比波長（λ1）以及支鏈淀粉的測定波長（λ4）和參比波長（λ3）。

1.2.5 樣品顯色條件的選擇 研究不同顯色pH值（2，3，4，5）、顯色溫度（15，20，25，30℃）和顯色時間（15，30，45，60，75，90，105，120，135，150，165，180min）對直鏈和支鏈淀粉測定波長下吸光度和吸光度差值的影響，選擇適宜的顯色條件。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)1.2.5得出的顯色條件，配制直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（1）直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取0.5，0.9，1.3，1.7，2.1，2.5mL的1g/mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入50mL的容量瓶中，加入30mL蒸餾水，以1mol/L和0.1mol/L鹽酸溶液調(diào)至pH＝3，加入0.5mL碘試劑，并用蒸餾水定容，靜置 30min，在λ2、λ1兩波長下分別測定Aλ2、Aλ1，得△A直＝Aλ2－Aλ1。以直鏈淀粉濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，△A直為縱坐標(biāo)，繪制直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

（2）支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL的1mg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液分別放入50 mL的容量瓶中，其余步驟同直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，在λ4、λ3兩波長下分別測定Aλ4、Aλ3，得△A支＝Aλ4－Aλ3。以支鏈淀粉濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，△A支為縱坐標(biāo)，繪制支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

1.2.7 精密度試驗 對同一樣品進行直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的同時測定，重復(fù)6次，計算平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.8 加標(biāo)回收率試驗 分別稱取不同量的直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品，添加到已測得直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的樣品中，測定加標(biāo)樣品中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，計算回收率。

1.2.9 綠豆樣品中直鏈和支鏈淀粉含量測定 精確稱取脫脂綠豆粉樣品0.1g于50mL燒杯內(nèi)，加入1mL無水乙醇潤濕，按照1.2.3的分散條件進行分散，以蒸餾水定容至50 mL。抽濾，取2.5mL的濾液加入50mL的容量瓶中，加入30mL蒸餾水，以1mol/L和0.1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH，加入0.5mL碘試劑，并用蒸餾水定容到刻度，按照1.2.5篩選的顯色條件進行顯色反應(yīng)。在λ2、λ1和λ4、λ3波長下測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長與參比波長的確定

用直鏈和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液分別與碘反應(yīng)，進行可見光波段掃描（400～800nm），并繪制于同一個坐標(biāo)系內(nèi)（見圖1），得到直鏈淀粉的最大吸收波長為λ2＝610nm，支鏈淀粉的最大吸收波長為λ4＝553nm。按照等吸收點波長法，通過作圖確定直鏈淀粉的測定波長和參比波長分別為λ2＝610nm和λ1＝498nm，支鏈淀粉的測定波長和參比波長分別為λ4＝553nm和λ3＝709nm。

圖1 直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品掃描圖（400～800nm）Figure 1 Spectrogram of amylose and amylopectin（400～800nm）

2.2 樣品顯色條件的選擇

2.2.1 pH值對吸光值的影響 由圖2可知，在pH 2～4范圍內(nèi)，A610nm、A553nm、A直和△A支的測定結(jié)果都沒有明顯差異，pH 5的條件下，吸光度和吸光度差值明顯減小，因此適宜的顯色反應(yīng)pH范圍為2～4。

2.2.2 顯色溫度對吸光值的影響 由圖3可知，當(dāng)顯色溫度為20℃時，測得吸光度和吸光度差值均為最大，因此選擇20℃作為最適顯色溫度。

2.2.3 顯色時間對吸光值的影響 由圖4可知，顯色反應(yīng)進行約15min時，反應(yīng)尚未完全達到平衡，測定結(jié)果不穩(wěn)定；當(dāng)顯色超過120min后，測得值呈現(xiàn)出較明顯的下降趨勢。因此建議在顯色反應(yīng)30～120min內(nèi)對樣液進行檢測。

圖2 顯色反應(yīng)pH對吸光值的影響Figure 2 The infulence of color reaction pH on photometric absorption

圖3 顯色溫度對吸光值的影響Figure 3 The infulence of color reaction temperature on photometric absorption

圖4 顯色時間對吸光值的影響Figure 4 The infulence of color reactiontime on photometric absorption

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖5可知，直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：△A直＝12.411C直－0.044 5（R2＝0.999 4），直鏈淀粉濃度在10～50mg/L時，溶液濃度與吸光度差值有良好的線性關(guān)系。

圖5 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 5 The standard cure of amylose

圖6 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 6 The standard cure of amylopectin

2.4 方法精密度評價

由表1可知，本方法重復(fù)性好，用雙波長分光光度法同時測定綠豆中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量精密度高。

2.5 加標(biāo)回收率

由表2可知，直鏈淀粉和支鏈淀粉的平均回收率分別為94.10%和90.94%。由此可見，雙波長法同時測定直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，結(jié)果可靠。

2.6 綠豆中直鏈和支鏈淀粉含量測定

由表3可知，直鏈淀粉含量在11.70%～12.67%，支鏈淀粉含量在32.70%～34.22%。鐘葵等［10］采用愛爾蘭Megazyme公司的淀粉試劑盒測定20個綠豆樣品中總淀粉和直鏈淀粉含量，變幅分別為37.48%～47.63% 和10.41%～15.84%。 林 偉 靜 等［2］將 綠 豆 淀 粉 從 綠 豆 中 分 離出來后，測得16個品種來源的綠豆淀粉中總淀粉含量和直鏈淀粉含量變幅分別為85.67%～92.98%和23.65%～34.08%。由此推算直鏈和支鏈淀粉質(zhì)量比在26∶74～39∶61。本研究結(jié)果與之一致。李文浩等［1］測得9個品種綠豆總淀粉含量、直鏈淀粉含量范圍分別為54.73%～57.99%，40.44%～41.82%。劉襄河等［3］測得綠豆淀粉中直鏈和支鏈淀粉含量分別為56.31%和16.95%，二者質(zhì)量比大約為77∶23。本研究結(jié)果與之差異較大，原因可能是樣品來源或檢測方法的不同。

表1 方法精密度試驗結(jié)果Table 1 The precision test results of the method

表2 直鏈淀粉和支鏈淀粉的回收率試驗結(jié)果Table 2 The recovery test results of amylose and amylopectin

表3 3種綠豆中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量Table3 Amylose and amylopectin content in 3kinds of mung bean（n＝3）

3 結(jié)論

雙波長分光光度法是對共存組分不分離定量測定的有效方法之一，此法操作簡單，精密度高，回收率良好，可以應(yīng)用于綠豆中直鏈和支鏈淀粉含量兩個指標(biāo)的同時測定。

本研究對樣品顯色反應(yīng)條件進行探討，結(jié)果表明，適宜的顯色反應(yīng)條件為：pH 2～4，顯色溫度20℃，顯色時間30～120min。

通過雙波長吸收光譜圖確定了直鏈淀粉的測定波長和參比波長為610nm和498nm，支鏈淀粉為553nm和709 nm。建立了直鏈淀粉和支鏈淀粉回歸方程，直鏈淀粉在10～50mg/L線性良好（R2＝0.999 4），支鏈淀粉在20～120 mg/L線性良好（R2＝0.999 1），符合比爾定律。并測得3種綠豆中直鏈淀粉含量為11.70%～12.67%，支鏈淀粉含量為32.70%～34.22%，直鏈淀粉與支鏈淀粉質(zhì)量比為26∶74～28∶72。

由于樣品來源不同或檢測方法不同，不同文獻報道的綠豆淀粉含量測定結(jié)果差異較大，在實際應(yīng)用中應(yīng)加以注意，對影響檢測結(jié)果的各種因素（如樣品中其他組分、樣品分散條件等）仍有待深入研究。

1 李文浩，譚斌，劉宏，等.我國9個品種綠豆淀粉的理化性質(zhì)研究［J］.中國食品學(xué)報，2013，13（4）：58～64.

2 林偉靜，曾志紅，鐘葵，等.不同品種綠豆的淀粉品種特性研究［J］.中國糧油學(xué)報，2012，27（7）：47～51.

3 劉襄河，鄭麗璇，鄭麗勉，等.雙波長法測定常用淀粉原料中直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（18）：97～100.

4 常虹，周家華，蘭彥平.葛根淀粉提取及直鏈、支鏈淀粉的雙波長測定［J］.食品工業(yè)科技，2009，30（11）：239～240，276.

5 林美娟，宋江峰，李大婧，等.用雙波長分光光度法測定鮮食玉米中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，22（12）：117～119.

6 包錦淵，李軍喬，韋梅琴，等.藏藥蕨麻中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的測定［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（3）：281～283.

7 蔣卉，胡中澤.雙波長法測定秈米中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量［J］.糧食與飼料工業(yè)，2013（2）：22～25.

8 吳仲，梁一池，陳詩強.錐栗中直鏈和支鏈淀粉含量同時檢測方法研究［J］.食品與機械，2014，30（2）：72～74，98.

9 崔克宇，呂明，王仁章，等.碘與淀粉反應(yīng)條件的實驗研究［J］.科技信息，2007（12）：29～31.

10 鐘葵，佟立濤，劉麗婭，等.綠豆淀粉性質(zhì)和糊化特性研究［J］.作物雜志，2013（2）：134～138.