趙玉萍 王煨捷 楊 莉

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

凹土是凹凸棒石黏土的簡(jiǎn)稱(chēng)，是天然非金屬富鎂鋁硅酸鹽黏土礦物，表面含有大量極性羥基，是一維納米棒晶形態(tài)結(jié)構(gòu)，其獨(dú)特的晶體結(jié)構(gòu)和堆積方式，使凹土具有較好的膠體性能、吸附能力等優(yōu)點(diǎn)［1，2］，還具有保護(hù)消化道黏膜、作為營(yíng)養(yǎng)元素載體、促進(jìn)養(yǎng)分吸收及吸附有毒物質(zhì)等生物活性功能［3］。凹土作為一種新型材料已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、石油、建材、農(nóng)業(yè)和環(huán)保等領(lǐng)域［4］。

乳酸桿菌是能夠產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛存在于人和動(dòng)物的胃腸道內(nèi)，是具有重要生理功能的腸道益生菌［5］。

益生菌常見(jiàn)微膠囊產(chǎn)品在一定程度上能夠?qū)θ撕蛣?dòng)物胃腸道逆環(huán)境具有一定的耐受性，但常見(jiàn)微膠囊生產(chǎn)工藝比較復(fù)雜，成本也高，其粒徑分布一般為微米級(jí)，若作為食品或飼料添加劑，分散性不好［6］。本研究擬以大豆分離蛋白、植物油復(fù)合凹土制備成乳狀液，盡管該乳狀液具熱力學(xué)不穩(wěn)定性，但因其粒徑小且分布范圍較窄，所以作為食品或飼料添加劑使用時(shí)較為方便。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸桿菌：本實(shí)驗(yàn)室保藏；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：TGC-16G-A型，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；

紫外光柵分光光度計(jì)：752型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：HWS智能型，寧波新江南儀器有限公司；

pH酸度計(jì)：PHSJ-4A型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

大豆分離蛋白：生化試劑，北京奧博星生物試劑有限公司；

植物油：食品一級(jí)，金龍魚(yú)股份有限公司；

凹土：原礦，盱眙博圖凹土高新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；

胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖：生化試劑，日本Sigma公司；

其他試劑：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基及人工胃、腸液配制方法

1.2.1 MRS培養(yǎng)基 蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5 g，磷酸氫二銨2g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，吐溫80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，H2O 1 000mL，pH 6.2～6.4，121℃滅菌15min［7］。

1.2.2 人工胃、腸液

（1）人工胃液：胃蛋白酶1%，NaCl 0.2%，用1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 至2.5［8］。

（2）人工腸液：胰蛋白酶1%，KH2PO41.4%，用0.4%的 NaOH 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH 至6.8［8］。

人工胃液和腸液配好后用0.2μm濾膜過(guò)濾備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備 乳酸桿菌接種于 MRS培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24h，于7 000r/min離心12min棄上清液，取菌泥沉淀，以無(wú)菌生理鹽水離心洗滌2次后，將菌體懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，并將菌體濃度調(diào)節(jié)至108CFU/mL。

1.3.2 凹土的處理 將未經(jīng)處理的凹土研磨，200目過(guò)篩，以10%的量加入去離子水，磁力攪拌器攪拌24h后，靜置4 h，取中間層凹土懸液，以10%的量加入去離子水，重復(fù)3次。懸浮于去離子水中，使 OD值達(dá)1.5，備用［8］。

1.3.3 大豆分離蛋白的處理 將7%（m/V）的大豆分離蛋白溶 于 0.7mol/L 的 HCl中，調(diào) 節(jié) pH 至 4.5，于 8 000r/min離心棄上清，并用去離子水補(bǔ)足至初始體積，以1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至10，靜置澄清后待用［9］。

1.3.4 乳化液制備方法 大豆分離蛋白與凹土混合制備懸液，滴入含0.2%吐溫80的植物油中，攪拌，靜置30min，使乳化層和水層及油層分離，得到乳化層。

（1）水包油（O/W）型乳化液制備：O/W 型乳化液是將油相高度分散在水相中，本試驗(yàn)中以植物油為油相，與處理后的大豆分離蛋白、凹土及菌懸液形成的水相混合制成穩(wěn)定的乳化液，但該乳化液的形成是非自發(fā)過(guò)程，因此需要加入表面活性劑吐溫80。經(jīng)多次單因素試驗(yàn)確定最佳添加順序?yàn)椋涸诰鷳乙褐幸来翁砑影纪翍乙?、大豆分離蛋白、植物油及吐溫80。乳酸桿菌懸液濃度為4.8×108CFU/mL，按上述的順序依次加入，振蕩10min后靜置30min，待油層、乳化層和水層逐漸分層后，取中間乳化層，采用稀釋涂布法，于MRS培養(yǎng)基中涂布，得乳化包埋活菌數(shù)，計(jì)算包埋率，以直接測(cè)量法測(cè)量各試樣乳化度，并用SDS分光光度法再次驗(yàn)證乳化的效果。

（2）油包水（W/O）型乳化液制備：W/O型乳化液即將水相高度分散在油相中，將油相和水相各組成成分進(jìn)行單因素試驗(yàn)，獲得最佳乳化條件。

（3）正交試驗(yàn)：比較O/W和 W/O型乳化液各項(xiàng)指標(biāo)，選擇最佳乳化液，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，獲得最優(yōu)乳化條件。

1.3.5 菌體檢測(cè)方法

（1）水包油型包埋率［10，11］：取乳化層經(jīng)梯度稀釋后，于MRS培養(yǎng)基中涂布，測(cè)定CFU，計(jì)算包埋后總菌體CFU，以此數(shù)值除以起始總菌體數(shù)CFU，得水包油型菌體包埋率。

（2）油包水型包埋率［10，11］：取未包埋部分液體，測(cè)定CFU，計(jì)算未包埋總菌體CFU，以此數(shù)值除以起始總菌體數(shù)CFU，得未包埋率，再按式（1）計(jì)算油包水型包埋率。

（3）釋放率：在人工模擬胃腸環(huán)境中，每隔1h或2h取樣，于MRS培養(yǎng)基中涂布，測(cè)定CFU，計(jì)算人工胃腸液總CFU，以此數(shù)值除以乳化樣品中總菌體數(shù)CFU，得菌體釋放率。

1.3.6 乳化性能測(cè)定方法

（1）直接測(cè)量法：按1.3.5制備乳化液，靜置后呈現(xiàn)油、乳液、水3個(gè)清晰的界面，測(cè)量乳化層體積、試樣總體積，運(yùn)用式（2）計(jì)算乳化能力（Ec）［12］。

（2）分光光度法：以0.1%（m/V）SDS為空白，并用其稀釋乳化液，于500nm處測(cè)量各樣品吸光度值。由于SDS是表面活性劑，與油作用后即可破乳，因此0min時(shí)的吸光度值可表示乳化試樣的乳化性［13］。

2 結(jié)果與討論

2.1 水包油乳化液制備試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，水包油的包埋率都在50%～70%，多數(shù)為60%左右。且包埋效果和乳化性能相關(guān)參數(shù)，即直接測(cè)量法結(jié)果和分光光度法測(cè)定乳化性的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。但本試驗(yàn)組的最佳乳化效果仍然不明顯，并且試驗(yàn)中各組試樣均存在一定的絮狀沉淀。

2.2 油包水乳化液制備試驗(yàn)結(jié)果分析

由表2、3可知，油包水的包埋率普遍都比水包油的高，最高達(dá)到了85.11%。經(jīng)過(guò)直接測(cè)量法和產(chǎn)品乳化性能測(cè)定，油包水型中分離蛋白、吐溫80、凹土和植物油的添加量分別為2.0，1.0，1.5，3.0mL。以此試驗(yàn)參數(shù)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

2.3 油包水乳化條件正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)上述單因素優(yōu)化結(jié)果，選擇大豆分離蛋白、凹土、吐溫80和植物油的量4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，因素及水平見(jiàn)表4。試驗(yàn)菌液濃度為5.6×1010CFU/mL，以乳化性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，4個(gè)因素中對(duì)乳化性影響的顯著程度為：植物油＞凹土＞大豆分離蛋白＞吐溫80，乳化最佳條件為：大豆分離蛋白含量為2.0mL、凹土含量為1.5mL、吐溫80含量為1.4mL、植物油含量為3mL。

根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，A2B2C3D2組是最優(yōu)條件，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，乳化性達(dá)到了2.176，每毫升活菌數(shù)為5.171×1010CFU，包埋率為92.31%。

表1 水包油型試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of the oil-in-water type

表1 水包油型試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of the oil-in-water type

菌、植物油、凹土均為1mL。

分離蛋白量/mL吐溫80/mL包埋率/%乳化能力/% OD500nm 0.2 64.56 21.74 1.032 1 0.6 70.23 28.00 1.175 1.0 70.71 28.57 1.328 0.2 62.31 19.23 1.245 2 0.6 62.67 19.64 1.178 1.0 64.50 21.64 1.213 0.2 62.41 19.35 1.278 3 0.6 60.00 16.67 1.112 1.0 61.71 18.57 1.008 0.2 63.75 20.83 0.912 4 0.6 63.95 21.05 0.958 1.0 64.12 21.25 0.745 0.2 66.95 17.36 0.902 5 0.6 55.46 11.62 0.933 1.0 50.40 16.00 0.701

表2 油包水型試驗(yàn)分離蛋白和吐溫80測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of the water-in-oil type of soy protein and Tween 80

表2 油包水型試驗(yàn)分離蛋白和吐溫80測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of the water-in-oil type of soy protein and Tween 80

菌、凹土均為1mL，植物油2mL。

分離蛋白量/mL吐溫80/mL包埋率/%乳化能力/% OD500nm 0.2 75.11 38.46 1.122 1 0.6 74.25 37.50 1.346 1.0 78.00 41.67 1.612 0.2 70.98 40.87 1.678 2 0.6 67.77 45.30 1.787 1.0 83.20 58.57 1.913 0.2 66.75 29.17 1.812 3 0.6 64.19 26.32 1.511 1.0 74.25 37.50 1.642 0.2 62.45 24.39 1.213 4 0.6 58.28 19.76 1.387 1.0 61.50 23.33 1.125 0.2 61.04 22.82 0.937 5 0.6 58.31 19.79 1.131 1.0 63.00 25.00 0.911

表3 油包水型試驗(yàn)凹土和植物油測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of the water-in-oil type of attapulgite clay and vegetable oil

表3 油包水型試驗(yàn)凹土和植物油測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of the water-in-oil type of attapulgite clay and vegetable oil

分離蛋白2mL，菌、吐溫80 1mL。

凹土/mL植物油/mL包埋率/%乳化能力/% OD500nm 1 59.12 17.81 0.765 0.25 2 60.17 16.73 0.874 3 61.32 19.28 0.933 1 58.91 18.22 0.976 0.50 2 62.11 17.35 0.982 3 64.65 20.37 1.105 1 63.52 27.81 1.032 0.75 2 69.76 30.97 1.137 3 72.52 35.89 1.165 1 77.65 42.31 1.178 1.00 2 83.20 58.57 1.913 3 75.63 41.79 1.213 1 63.84 41.26 1.312 1.25 2 73.12 38.79 1.129 3 82.27 56.35 1.539 1 82.14 57.65 1.891 1.5 2 84.38 60.29 1.957 3 85.11 61.32 1.975 1 83.19 59.93 1.879 1.75 2 80.26 55.37 1.653 3 82.17 58.54 1.732

表4 因素水平表Table 4 Factors and levels table mL

2.4 油包水乳化液人工模擬胃液和腸液中存活結(jié)果

將上述各組乳化試樣，模擬人工胃液和腸液，檢測(cè)各時(shí)間段活菌數(shù)。各組試樣在人工胃液和腸液中活菌數(shù)見(jiàn)圖1、2。

各試驗(yàn)組在胃中隨著時(shí)間的增加有所下降，在腸中活菌數(shù)剛開(kāi)始隨著時(shí)間的增加而增加，即菌體不斷釋放的過(guò)程，普遍在第6小時(shí)時(shí)達(dá)到最大，之后又逐漸衰減，即使在10h后，活菌數(shù)數(shù)量仍超過(guò)108CFU/mL，因此該乳油能夠很好地發(fā)揮乳酸桿菌的作用。比較各試驗(yàn)組，其中又以3號(hào)試驗(yàn)組在腸中的活菌數(shù)釋放最高，在人工腸液的第6小時(shí)達(dá)到最大釋放效率。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal results of conditions

圖1 人工模擬胃液各時(shí)間段活菌數(shù)Figure 1 CFU of emulsiton in artificial simulation gastric juice

圖2 人工模擬腸液中各時(shí)間段活菌數(shù)Figure 2 CFU of emulsiton in artificial simulation intestinal juice

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以凹土懸液、大豆分離蛋白、植物油及吐溫80制備乳酸桿菌水包油型乳化液，水包油型乳化液包埋率低，乳化能力一般；油包水型乳化液，包埋率好，乳化性能好，在人工模擬胃液中存活率高，在人工模擬腸液中第6小時(shí)可達(dá)到益生菌的最大釋放，有利于益生菌很好地發(fā)揮腸定植作用。說(shuō)明采用凹土復(fù)合大豆分離蛋白和植物油制備的油包水型乳化液，可以很好地包埋益生菌，抵抗胃的逆環(huán)境，以較高的存活率到達(dá)腸道，并在腸道中達(dá)到最高量的釋放。本試驗(yàn)為更好地開(kāi)發(fā)益生菌保護(hù)劑材料提供了較好的參考，同時(shí)為凹土作為新型材料在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

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