王麗霞，陳永勝，穆莎茉莉，李國(guó)瑞，黃鳳蘭，羅　蕊，邢　超，孫華軍，李　越，王　月

（1．內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古通遼028000；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028000）

乙醇浸提法提取蓖麻餅粕總黃酮的工藝研究

王麗霞1，2，陳永勝2，3，*，穆莎茉莉2，*，李國(guó)瑞2，3，黃鳳蘭2，3，羅蕊1，2，邢超2，3，孫華軍2，3，李越2，3，王月3

（1．內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古通遼028000；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028000）

本文采用乙醇浸提法提取蓖麻餅粕中的黃酮類(lèi)化合物，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)蓖麻餅粕總黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到乙醇浸提法提取蓖麻餅粕總黃酮的最優(yōu)工藝為：乙醇濃度70%，料液比1∶25（g/mL），提取溫度75℃，提取時(shí)間3h，此時(shí)總黃酮的提取率為2.50%，換算成含量為25.03mg/g。該工藝條件下總黃酮的提取率較高，連續(xù)兩次浸提提取率可達(dá)總提取率的96.01%，且提取方法簡(jiǎn)單。本研究對(duì)蓖麻餅粕總黃酮工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

蓖麻餅粕，總黃酮，提取，工藝優(yōu)化

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)以C6-C3-C6為基本碳架的天然化合物，也是多種中草藥及藥用植物的有效成分。大量研究表明黃酮類(lèi)化合物具有多種生物活性和藥理作用[1]，如抗菌[2]、消炎[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、鎮(zhèn)痛[6]、鎮(zhèn)咳及抑制脂肪酶活性等的作用，且對(duì)治療冠心病、心絞痛等疾病有顯著效果[7]。特別是抗自由基和抗癌、防癌[8-9]的作用使黃酮類(lèi)化合物的研究進(jìn)入了新的熱潮，同時(shí)，黃酮類(lèi)化合物的安全、無(wú)毒，促使其在化妝品、醫(yī)藥、食品加工等方面均具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

蓖麻是一種油料經(jīng)濟(jì)作物，廣泛分布于世界各地，主要以蓖麻籽和蓖麻油為主要用途[10]，而蓖麻餅粕作為蓖麻籽榨油后的副產(chǎn)品，因其含有多種有毒物質(zhì)，還未較好的開(kāi)發(fā)利用，大多被當(dāng)做廢料遺棄，只有少數(shù)用做飼料，這就大大限制了它的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。蓖麻葉和花中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物[11]，而關(guān)于蓖麻餅粕中黃酮類(lèi)化合物的研究還尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，從蓖麻餅粕中提取黃酮這種天然物質(zhì)，不僅為黃酮化合物的研究開(kāi)發(fā)了新的資源，而且拓寬了蓖麻綜合應(yīng)用途徑，提高其綜合利用價(jià)值，對(duì)推動(dòng)蓖麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有積極的作用。本實(shí)驗(yàn)利用乙醇浸提法提取了蓖麻餅粕中的黃酮類(lèi)物質(zhì)，在此基礎(chǔ)上考查了單因素對(duì)其提取率的影響，并設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，確定了提取蓖麻餅粕中總黃酮類(lèi)物質(zhì)的最優(yōu)工藝條件，為蓖麻餅粕的開(kāi)發(fā)利用提供良好的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和工藝參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蓖麻餅粕由通遼通華蓖麻化工有限責(zé)任公司提供；蘆丁標(biāo)樣購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、石油醚（60～90℃）均為分析純。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AO104電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；JJ-2組織勻漿搗碎機(jī)江蘇省大地自動(dòng)化儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理蓖麻餅粕粉碎后過(guò)60目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取10g粉末，用濾紙包好，置于索氏提取器中，采用石油醚進(jìn)行脫脂處理，按料液比1∶20（g/mL），回流溫度為80℃，回流至虹吸管中溶液的顏色為無(wú)色為止，然后自然風(fēng)干，密封備用[12]。

1.2.2測(cè)定波長(zhǎng)的選擇與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考蔣新龍的方法[11]略做修改。用80%的乙醇溶液配制濃度為0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4℃冰箱避光冷藏。吸取1mL的濃度為0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，加80%乙醇至5mL，加入5%NaNO2溶液0.5mL，搖勻放置6min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.5mL搖勻，再放置6min，加入4%NaOH溶液4mL，搖勻，放置10min，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)480～530nm范圍內(nèi)以5nm為間隔單位掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果在510nm處有最大吸收峰，故選擇510nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

準(zhǔn)確吸取濃度為0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，按上述方法顯色定容，以不加黃酮提取液為空白對(duì)照，在510nm處測(cè)定其吸光度值。以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)x，所測(cè)得的吸光度A為縱坐標(biāo)y，繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3蓖麻黃酮化合物的提取及含量測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品干粉3g，加入一定量的乙醇溶液，用乙醇浸提法提取，抽濾后，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，加80%的乙醇溶解，定容到100mL容量瓶，精密吸取黃酮提取液1.0mL于10mL容量瓶中，按上述測(cè)定總黃酮類(lèi)含量的方法，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)其吸光度值，代入回歸方程，求出提取液中黃酮類(lèi)化合物的含量，同時(shí)做3次平行實(shí)驗(yàn)，并按下式計(jì)算總黃酮提取率：

總黃酮提取率（%）＝C×V×10-3（g）/所用原料重量（g）×100

總黃酮含量（mg/g）=C×V（mg）/所用原料重量（g）

式中：C為回歸方程計(jì)算所得值；V為提取液總體積（即定容的容量瓶體積100mL）。

1.2.4總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)采用乙醇浸提法提取蓖麻餅粕中的總黃酮，并設(shè)置單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間四個(gè)因素對(duì)蓖麻餅粕中的總黃酮提取率的影響。

1.2.4.1乙醇濃度對(duì)蓖麻餅粕中總黃酮提取率的影響分別稱(chēng)取脫脂蓖麻餅粕粉3g，以乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶液為溶劑，在料液比為1∶20，提取溫度為65℃條件下提取2h，抽濾后，收集濾液，按1.2.3的方法測(cè)定。

煤炭在開(kāi)采過(guò)程中，需要挖掘大量的巷道來(lái)開(kāi)采作業(yè)。由于煤礦地理位置及水文等多種因素的影響，致使煤礦開(kāi)采頻繁發(fā)生安全事故，嚴(yán)重威脅到施工人員的生命安全。因此，必須采用合理的掘進(jìn)支護(hù)技術(shù)。

1.2.4.2料液比對(duì)蓖麻餅粕中總黃酮提取率的影響分別稱(chēng)取脫脂蓖麻餅粕粉3g，在乙醇濃度為70%，溫度為65℃，料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的條件下提取2h，收集濾液，按1.2.3的方法測(cè)定。

1.2.4.3提取溫度對(duì)蓖麻餅粕中總黃酮提取率的影響分別稱(chēng)取脫脂蓖麻餅粕粉3g，在乙醇濃度為70%，料液比為1∶20，溫度為35、45、55、65、75、85℃的條件下提取2h，收集濾液，按1.2.3的方法測(cè)定。

1.2.4.4提取時(shí)間對(duì)蓖麻餅粕總黃酮提取率的影響分別稱(chēng)取脫脂蓖麻餅粕粉3g，在乙醇濃度為70%，料液比為1∶20，溫度為65℃，提取時(shí)間為0.5、1、1.5、2、2.5、3h的條件下進(jìn)行處理，收集濾液，按1.2.3的方法測(cè)定，比較不同時(shí)間對(duì)蓖麻餅粕總黃酮提取率的影響。

1.2.5總黃酮提取的正交實(shí)驗(yàn)為了獲得蓖麻餅粕總黃酮的最佳提取工藝條件，本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）4個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用4因素3水平來(lái)進(jìn)一步確定總黃酮的最佳提取工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1　L9（34）因素水平表Table.1　Factors and levels of the test L9（34）

1.2.6數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of rutin

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1乙醇濃度對(duì)蓖麻餅粕中總黃酮提取率的影響

由圖2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，蓖麻餅粕總黃酮的提取率也逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)，蓖麻餅粕中的總黃酮提取率達(dá)到最大值，此后再增加乙醇濃度，總黃酮的提取率反而下降。這可能是由于隨著乙醇濃度的增大，葉綠素、親脂性強(qiáng)的成分和其他的一些醇溶性雜質(zhì)等的浸出量也增加，而這些物質(zhì)的存在會(huì)影響黃酮類(lèi)化合物檢測(cè)，從而導(dǎo)致黃酮化合物提取率的下降，并且隨著乙醇濃度的增加，生產(chǎn)成本在增加，而雜質(zhì)浸出量的增加又會(huì)給后續(xù)操作帶來(lái)不便，因此確定70%為提取蓖麻餅粕總黃酮的最佳乙醇濃度。

圖2　乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2　Influence of alcohol concentration on extraction ratio of the total flavonoids

2.2.2料液比對(duì)蓖麻餅粕中總黃酮提取率的影響由圖3可看出，隨著料液比的增大，蓖麻餅粕總黃酮的提取率亦增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20時(shí)，溶質(zhì)中的有效成分已基本溶出，再增加料液比，蓖麻餅粕中總黃酮的提取率增加緩慢，可見(jiàn)，在一定范圍內(nèi)，溶劑用量增加使單位體積的溶劑中溶質(zhì)的濃度降低，這有利于溶質(zhì)的擴(kuò)散，從而促進(jìn)黃酮類(lèi)化合物的浸出，溶劑用量少，提取不太完全，但當(dāng)溶劑量再增大時(shí)，固液接觸飽和[13]，不能明顯提高總黃酮提取率，且過(guò)量的浸提溶劑反而會(huì)造成一定的經(jīng)濟(jì)浪費(fèi)，并為后續(xù)的濃縮等操作帶來(lái)不必要的麻煩。綜合考慮浸提效果和經(jīng)濟(jì)及后續(xù)處理的復(fù)雜性等方面的因素，用量不宜過(guò)大，故將最佳料液比定為1∶20較合適。

圖3　料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3　Influence of solid-liquid ratio on extraction ratio of the total flavonoids

2.2.3提取溫度對(duì)蓖麻餅粕中總黃酮提取率的影響

從圖4中可以看出，隨著提取溫度的升高蓖麻餅粕中的總黃酮類(lèi)化合物的提取率也逐漸增大，這是因?yàn)殡S著溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，滲透、溶解和擴(kuò)散作用增強(qiáng)，從而促進(jìn)黃酮類(lèi)化合物的溶出。而當(dāng)溫度增加到85℃時(shí)蓖麻餅粕總黃酮的提取率反而下降，這可能是由于，一方面，溫度過(guò)高，雜質(zhì)的溶出量增加，部分熱不穩(wěn)定的黃酮類(lèi)化合物分解所致；另一方面，溫度超過(guò)了乙醇的沸點(diǎn)78℃，導(dǎo)致乙醇揮發(fā)損失，從而降低了提取率。故本實(shí)驗(yàn)選75℃為提取蓖麻餅粕總黃酮的最佳提取溫度。

圖4　提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4　Influence of extracting temperature on extraction ratio of the total flavonoids

2.2.4提取時(shí)間對(duì)蓖麻餅粕總黃酮提取率的影響由圖5可以看出，在一定的時(shí)間段內(nèi)，蓖麻餅粕中總黃酮的提取率隨時(shí)間的增加而快速增加，但隨著時(shí)間的再延長(zhǎng)，總黃酮提取率增長(zhǎng)幅度不大，這就表明總黃酮的提取已基本完全。由此可見(jiàn)，不同提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響很大，時(shí)間過(guò)短，總黃酮未能充分浸出，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不利于生產(chǎn)周期，增加生產(chǎn)成本和消耗，還可能導(dǎo)致黃酮類(lèi)化合物的熱分解損失，或雜質(zhì)溶出，影響黃酮的測(cè)定。綜上分析選擇2.5h為最佳提取時(shí)間。

2.3正交實(shí)驗(yàn)

考慮到各因素之間的交互作用，本實(shí)驗(yàn)以蓖麻餅粕總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，選用4因素3水平的正交方法進(jìn)一步考察了乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)蓖麻餅粕總黃酮提取率的影響，以確定最佳提取工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表2。

圖5　提取時(shí)間對(duì)蓖麻餅粕總黃酮提取率的影響Fig.5　Influence of extracting time on extraction ratio of the total flavonoids

表2　L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table.2　Results of the orthogonal test L9（34）

由表2可知，各因素及其水平對(duì)蓖麻餅粕中總黃酮提取率的影響表現(xiàn)出一定的差異性。4個(gè)影響因素的主次順序?yàn)镃＞A＞B＞D，即浸提溫度對(duì)提取率的影響最大，其次是乙醇濃度、料液比，而提取時(shí)間的影響最小。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出最佳提取工藝條件為A2B3C3D3，即乙醇濃度70%，料液比1∶25（g/mL），提取溫度75℃，提取時(shí)間3h。

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在乙醇濃度70%，料液比1∶25（g/mL），提取溫度75℃，提取時(shí)間3h的條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得蓖麻餅粕總黃酮的平均提取率為2.50%，換算成蓖麻餅粕黃酮含量為25.03mg/g，比正交表中的值高，故可確定此條件為最優(yōu)工藝條件。

為了考察最佳工藝的提取效果，在正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件下，提取5次，分別計(jì)算蓖麻餅粕總黃酮的提取率，結(jié)果如表3，通過(guò)連續(xù)5次提取，蓖麻餅粕中黃酮含量接近零，而連續(xù)兩次提取總黃酮的提取率已可達(dá)總提取率的96.01%，可見(jiàn)該工藝較好。

表3　總黃酮提取率隨提取次數(shù)的變化Table.3　The extraction rate of total flavonoids varies with the extraction times

3　結(jié)論與討論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出，提取蓖麻餅粕總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度70%，料液比1∶25（g/mL）、提取溫度75℃、提取時(shí)間3h，此時(shí)總黃酮的提取率為2.50%，換算成蓖麻餅粕黃酮含量為25.03mg/g，高于蓖麻葉（20.411mg/g）和花（18.655mg/g）中總黃酮的含量[11]，同時(shí)也高于同等方法下綠豆芽（6.8mg/g）[13]、豆粕（5.41mg/g）[14]、花生粕（1.6mg/g）[15]、綠豆皮（3.879mg/g）[16]等的總黃酮含量，可見(jiàn)蓖麻餅粕中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，是一種較好的獲取黃酮的新資源，有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，值得深入研究。

在最優(yōu)工藝條件下多次提取，乙醇浸提法的單次總黃酮提取率可達(dá)總提取率的84.68%，連續(xù)提取2次，總黃酮的提取率可達(dá)總提取率的96.01%。該法與超聲波法、微波法相比雖然耗時(shí)較長(zhǎng)，但總黃酮提取率較高，對(duì)設(shè)備要求不高，操作簡(jiǎn)單，工藝易于控制，且以乙醇為提取劑，具有成本低，對(duì)環(huán)境及人類(lèi)無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)。本研究為工業(yè)化提取蓖麻餅粕總黃酮提供了新的線索，為后續(xù)進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)蓖麻餅粕中的總黃酮提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為蓖麻餅粕的綜合利用開(kāi)辟了新的途徑，更為今后蓖麻餅粕總黃酮在食品、醫(yī)藥方面的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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Study on the extraction of the total flavonoids from castor bean meal by ethanol extraction technology

WANG Li-xia1，2，CHEN Yong-sheng2，3，*，MU Sha-moli2，*，LI Guo-rui2，3，HUANG Feng-lan2，3，LUO Rui1，2，XING Chao2，3，SUN Hua-jun2，3，LI Yue2，3，WANG Yue3
（1.College of Agriculture，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000，China；2.Inner Mongolia Industrial Engineering Research Center of Universities for Castor，Tongliao 028000，China；3.College of Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000，China）

The flavonoids from the castor bean meal were extracted by ethanol extraction technology.On the basis of single factor experiment，through the orthogonal test，the extraction conditions of total flavonoids from castor bean meal were optimized.The best optimal technological conditions for extraction of total flavonoids from castor were as follows：ethanol concentration was 70%，the ratio of solid to liquid was 1∶25（g/mL），extracting temperature was 75℃and extracting duration was 3h，then the extraction ratio of total flavonoids was 2.50%，converted to the content of 25.03mg/g.Under this condition，the extraction rate of flavonoids was higher，two consecutive extraction ratio could reach 96.01%.The extraction method was simple，which had a certain application value for industrialized production of total flavonoids of castor bean meal.

castor bean meal；total flavonoids；extraction；process optimization

TS201.1

B

1002-0306（2015）04-0282-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.053

2014－09-24

王麗霞（1990-），女，在讀碩士研究生，主要從事蓖麻功能性成分方面的研究。

陳永勝（1971-），男，教授，研究方向：生物技術(shù)。

穆莎茉莉（1979-），女，講師，研究方向：蓖麻餅粕功能性成分研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31060194）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NJZY14188）。