代文婷 李愛軍 鄭 楠 王加啟*

(1.吉林大學(xué)動物科技學(xué)院，長春 130062;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(北京)，北京 100193;3.農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(北京)，北京 100193;4.唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，唐山 063000)

乳蛋白是最富有營養(yǎng)價值的蛋白質(zhì)之一，也是衡量牛奶品質(zhì)的重要指標(biāo)，可分為酪蛋白和清蛋白，其中酪蛋白含量較多，約占80%。常見的酪蛋白一般有4種，分別是αs1－酪蛋白(αs1-casein，CSN1S1)、αs2 － 酪蛋白(αs2-casein，CSN1S2)、β －酪蛋白(β-casein，CSN2)和 κ －酪蛋白(κ-casein，CSN3)［1］，分別約占酪蛋白總量的 38% 、10% 、36%和12%［2］，其中 CSN3是唯一含有乳糖成分且對鈣不敏感的酪蛋白。研究表明，CSN3基因的表達(dá)對維持大鼠細(xì)胞中COP9信號小體(CSN)的完整性、保證細(xì)胞存活、維持乳腺細(xì)胞形態(tài)都至關(guān)重要，而且CSN3基因敲除的雌鼠不能哺乳，甚至喪失泌乳性能，因此CSN3基因是哺乳動物泌乳和繁殖所必需的［3－4］。一直以來，奶牛養(yǎng)殖者一直致力于牛奶中蛋白質(zhì)含量的提高，進(jìn)而提升牛奶的營養(yǎng)價值。

根據(jù)動物體的生長和氮代謝平衡特點，氨基酸通常被分為必需氨基酸(essential amino acids)和非必需氨基酸(non-essential amino acids)，亮氨酸就屬于必需氨基酸。Wu［5］于2010年提出功能性氨基酸(functional amino acids)的概念，即那些能調(diào)控生物體內(nèi)關(guān)鍵的代謝通路，以改善動物體的生理健康，促進(jìn)其生長發(fā)育，調(diào)控其泌乳以及生殖的氨基酸。而亮氨酸在機體中發(fā)揮著重要的營養(yǎng)生理作用，也是一類功能性氨基酸。概括起來主要功能包括3個方面，即氧化供能、調(diào)節(jié)機體免疫和調(diào)節(jié)機體(尤其是骨骼肌)蛋白質(zhì)代謝［6］。

目前，大多有關(guān)氨基酸影響乳腺上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的研究集中于對酪蛋白合成相關(guān)基因的影響，例如當(dāng)培養(yǎng)基中蛋氨酸濃度為57 mg/L時，CSN1S1的mRNA的表達(dá)水平最高［7］;當(dāng)培養(yǎng)基中精氨酸濃度為556.00 mg/L時，CSN3的表達(dá)量達(dá)到最高［1］。而亮氨酸對蛋白質(zhì)合成的調(diào)控研究最早致力于骨骼肌細(xì)胞，主要采用灌注或者靜脈注射的方法。Dardevet等［8］研究發(fā)現(xiàn)，注射亮氨酸的大鼠或新生仔豬的骨骼肌蛋白質(zhì)合成顯著增加，補充亮氨酸比其他必需氨基酸要更有利于氨基酸的利用與骨骼肌的合成。研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸能通過哺乳動物類帕霉素(mTOR)－真核起始因子4E(eIF4E)－核糖體蛋白S6(RPS6)信號通路來調(diào)控骨骼肌蛋白質(zhì)的合成［9－11］和乳腺組織中蛋白質(zhì)的合成［12－14］。此外，酪氨酸激酶(JAK)－ 轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)路徑是多種細(xì)胞因子共用的信號通路途徑，其廣泛參與細(xì)胞生長、增殖、應(yīng)激、凋亡等，可將細(xì)胞膜的信號直接傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，啟動基因 的 轉(zhuǎn) 錄。 目 前，Hu 等［15］研 究 發(fā) 現(xiàn)，0.900 0 mmol/L的精氨酸能顯著上調(diào)乳腺細(xì)胞中蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2(JAK2)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(STAT5)的基因表達(dá)，從而調(diào)控蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄過程。最新研究還發(fā)現(xiàn)，與其他組合相比，當(dāng)賴氨酸與蛋氨酸的比例為3∶1(賴氨酸為1.2 mmol/L，蛋氨酸為0.4 mmol/L)時，JAK2和STAT5基因表達(dá)顯著上調(diào)［5，14］。亮氨酸對骨骼肌蛋白質(zhì)調(diào)控機制已經(jīng)很清楚，而不同水平的亮氨酸對乳腺上皮細(xì)胞的增殖以及乳蛋白的合成調(diào)控作用還不是很透徹。本研究旨在以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，研究不同水平的亮氨酸對其增殖以及泌乳相關(guān)基因表達(dá)的影響，進(jìn)而能為亮氨酸對乳中酪蛋白合成的調(diào)控機理提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

1.1.1 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，貨號:11995－065/11765－054)、缺亮氨酸的 DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco定制，貨號:CM028817)、L－亮氨酸(Sigma，貨號:L8912 －100G)、胎牛血清(FBS，Gibco，貨號:10099－141)、胰蛋白酶(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號:C0203)、噻唑藍(lán)(MTT，Sigma，貨號:0793 －5G)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma，貨號:D4540)、青鏈霉素(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號:C0222)、RNA提取試劑盒(TIANGEN，貨號:74106)、反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒 (TaKaRa，貨 號:DRR037A)、實時定量 PCR試劑盒(TaKaRa，貨號:DRR820A)。

1.1.2 主要儀器

恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)、超凈工作臺(江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司)、冷凍離心機(德國Legend)、酶標(biāo)儀(美國 Gene)、實時定量 PCR儀(美國ABI7500)、倒置顯微鏡(日本 Olympus)、細(xì)胞計數(shù)儀(美國Bio-Rad)、RNA濃度測定儀(美國Thermo)等。

1.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法

荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法參照本實驗室前期建立的奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法［15］。采取1頭3周歲泌乳中期奶牛的乳腺組織，通過組織塊接種法對奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，經(jīng)純化可得到細(xì)胞形態(tài)均一的奶牛乳腺上皮細(xì)胞并處于正常的生理狀態(tài)，且具有正常的分泌功能。將奶牛乳腺上皮細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的 DMEM/F12生長培養(yǎng)基中(pH 7.4)，在38℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿，達(dá)到80% ～90%匯合時，用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液于38℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中消化待細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大縮成圓形時(8～15 min)，用培養(yǎng)基終止消化反應(yīng);用移液器反復(fù)吹打后，收集細(xì)胞懸液于15 mL離心管，500×g室溫離心5 min;棄上清液，加入新鮮的DMEM/F12生長培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸浮液。

1.3 細(xì)胞增殖檢測

1.3.1 種板

收集第4或5代乳腺上皮細(xì)胞，使用加入胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×105個/mL接種到 96孔板中，每孔200μL，四周邊緣孔加入無菌D-Hanks緩沖液，置于38℃、5%CO2培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)24 h。

1.3.2 換液

24 h后吸去各孔內(nèi)的培養(yǎng)基，用無菌D-Hanks緩沖液洗各孔2遍，向各孔中加入200μL不同水平亮氨酸的培養(yǎng)基(表1)，培養(yǎng)基中不添加胎牛血清。以不添加亮氨酸的為對照組(0×組)，每組設(shè)置3個重復(fù)孔，每板均設(shè)對照組。

1.3.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖

分別于接種后24、48、72 h小心吸去培養(yǎng)基，然后各孔加入MTT工作液(5 mg/mL)20μL，4 h后棄去上清，每孔中加入二甲基亞砜200μL，振蕩5 min后采用全自動酶聯(lián)免疫分析儀檢測各孔590 nm波長下的吸光度值(OD590nm)。細(xì)胞相對增殖率(relative proliferation rate，RGR)計算公式:

RGR=試驗組OD590nm/對照組OD590nm［5］。

?

1.4 實時定量PCR法檢測CSN3合成相關(guān)基因的表達(dá)

1.4.1 鋪板

收集第3或4代乳腺上皮細(xì)胞，使用加入胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/mL接種到6孔板中，每孔1.5 mL，共接種27個孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)24 h。

1.4.2 換液

24 h后，吸去各孔內(nèi)的培養(yǎng)基，用無菌D-hanks潤洗各孔2遍，然后加入不同水平亮氨酸的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4.3 總 RNA 提取

繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后，使用總RNA提取試劑盒(QIAGEN RNeasy Mini Kit)提取細(xì)胞總RNA，每個孔單獨提取，共提取27個孔，提取的總RNA經(jīng)濃度測定和純度檢測合格后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以用于下一步的實時定量PCR。

1.4.4 CSN3合成相關(guān)基因的表達(dá)檢測

試驗所用引物設(shè)計見下表2。選用核糖體蛋白S9(RPS9)作為內(nèi)參基因。選用TaKaRa實時定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)，反應(yīng)體系為20μL:10μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)、ROX Reference DyeⅡ(50 ×)0.4 μL，0.6 μL上游引物，0.6 μL 下游引物，2 μL cDNA模板，6.4μL雙蒸水。反應(yīng)程序:95℃，30 s;95℃，5 s，60 ℃退火延伸 34 s，40 個循環(huán)，熔解曲線程序為:95 ℃，15 s;55 ℃ ，1 min，95 ℃，15 s。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 9.2軟件PROC ANOVA對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，均值多重比較采用Duncan氏法，以P＜0.05為顯著性檢驗水平。統(tǒng)計所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基中亮氨酸水平對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

由表3可知，孵育24和48 h，培養(yǎng)基中添加亮氨酸能夠提高乳腺上皮細(xì)胞相對增殖率，0.25×組與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，而其余各組均顯著高于對照組(P＜0.05);孵育72 h，各亮氨酸添加組與對照組相比，細(xì)胞相對增殖率差異均顯著提高(P＜0.05)。低水平組(0.25×組～2×組)，細(xì)胞的相對增殖率隨著亮氨酸水平的升高而增大;3個時間點均以2×組細(xì)胞的相對增殖率最大;高水平組(2×組～32×組)，細(xì)胞的相對增殖率隨著亮氨酸水平的升高而有所下降。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加0.900 0 mmol/L亮氨酸對乳腺上皮細(xì)胞的促增殖作用最強，低水平和高水平的 促增殖作用均有所減弱。

表2 實時定量PCR引物序列Table 2 Sequences of primers for real-time PCR

表3 亮氨酸水平對奶牛乳腺上皮細(xì)胞相對增殖率的影響Table 3 Effect of leucine level on of bovine mammary epithelial cell proliferation rate(n=3)

2.2 培養(yǎng)基中亮氨酸水平對乳腺上皮細(xì)胞CSN3合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由表4可知，各亮氨酸試驗組與對照組比較，mTOR、核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)、真核細(xì)胞翻譯啟動因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)、JAK2和STAT5基因的相對表達(dá)量均差異顯著(P＜0.05);亮氨酸低水平組(0.25×組 ～2×組)mTOR、S6K1、JAK2和STAT5基因的相對表達(dá)量隨著水平的升高先降低后升高;這4種基因的表達(dá)量都以2×組達(dá)到最大，繼續(xù)升高亮氨酸水平，這些基因的表達(dá)量均有所下降。然而，亮氨酸處于低濃度水平(0.25×組～2×組)時，4EBP1基因的相對表達(dá)量隨著水平的升高而降低;4EBP1基因相對表達(dá)量以2×組達(dá)到最小;隨著亮氨酸水平的繼續(xù)升高，該基因的表達(dá)量有所升高。結(jié)果說明，亮氨酸能促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中mTOR、S6K1、JAK2和STAT5的表達(dá)，但是抑制4EBP1的表達(dá)。0.900 0 mmol/L(2×組)的亮氨酸水平對mTOR、S6K1、JAK2和STAT5這4種基因的上調(diào)表達(dá)作用最強，而對4EBP1的下調(diào)表達(dá)最強。

0.25 ×組、0.5×組、8×組和16×組CSN3基因的相對表達(dá)量與對照組比較差異均不顯著(P＞0.05)，其他各亮氨酸試驗組中CSN3基因的相對表達(dá)量與對照組比較差異顯著(P＜0.05)，該基因的相對表達(dá)量以2×組最大。這說明亮氨酸對CSN3基因表達(dá)的促進(jìn)作用與劑量有關(guān)，當(dāng)亮氨酸水平為0.900 0 mmol/L(2×組)時，該基因的相對表達(dá)量最高，上調(diào)作用最強，繼續(xù)升高水平，其表達(dá)量有所下降。

表4 亮氨酸水平對奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN3合成相關(guān)基因表達(dá)相對表達(dá)量的影響Table 4 Effects of leucine level on the relative expression levels of genes related to CSN3 synthesis(n=3)

3 討論

3.1 培養(yǎng)基中亮氨酸水平對乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

乳腺組織在動物體內(nèi)的增殖和分化受許多因素如激素、維生素、氨基酸、微量元素、生長因子等的影響，這些因素也能影響體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞的增殖、分化、泌乳等功能［20］。龐學(xué)燕等［21］研究表明，24 h時，與不添加亮氨酸的對照組相比，外源添加177.15 mg/L亮氨酸顯著促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖。徐柏林［1］研究發(fā)現(xiàn)24、48和72 h時，添加556.00 mg/L的精氨酸對奶牛乳腺細(xì)胞的促增殖作用最強。適宜水平的特定氨基酸在調(diào)控細(xì)胞增殖的過程中，存在一種時間和水平的最優(yōu)化效應(yīng)，一旦超過或者低于這個水平時，其促增殖效應(yīng)會相應(yīng)地降低［22］。有研究表明，與添加177.15 mg/L亮氨酸試驗組相比，添加LY294002抑制劑(一種能抑制mTOR信號通路的抑制劑)亮氨酸試驗組的奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖顯著降低［23］。王志鋼等［22］和 Mercier等［24］均指出 mTOR 信號通路可以介導(dǎo)調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，繼而通過細(xì)胞數(shù)量來調(diào)控乳蛋白的合成。在動物體內(nèi)，亮氨酸可以在支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成α－酮戊二酸，α－酮戊二酸一方面能調(diào)節(jié)mTOR的活性，從而有效提高蛋白質(zhì)的合成效率，有利于細(xì)胞的增殖［5－6］;另一方面還能降低蛋白質(zhì)的分解率，并改善機體的免疫水平，從而促進(jìn)機體的生長。另外，有一些學(xué)者認(rèn)為α－酮戊二酸還能刺激胰島素的分泌，進(jìn)而調(diào)控生物體的生長代謝［8］。

3.2 培養(yǎng)基中亮氨酸水平對乳腺上皮細(xì)胞CSN3合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響

CSN3是一種表達(dá)相對穩(wěn)定的酪蛋白基因，因而本試驗以CSN3為中心來探索乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)。氨基酸對酪蛋白合成影響主要表現(xiàn)在2個方面:轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和翻譯水平調(diào)控。酪蛋白基因的轉(zhuǎn)錄過程主要由信號轉(zhuǎn)換和STAT5調(diào)控［25］，JAK2 能磷酸化 STAT5，繼而使 STAT5 形成二聚體，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核并能與核內(nèi)的特異序列結(jié)合［26－27］。氨基酸對酪蛋白表達(dá)調(diào)控主要是通過mTOR信號通路介導(dǎo)，氨基酸主要通過激活哺乳動物雷帕霉素靶標(biāo)復(fù)合物1(mTORC1)，一方面促使核糖體蛋白S6激酶的磷酸化并激活，繼而促進(jìn)mRNA的翻譯;另一方面促使4EBP1發(fā)生磷酸化，釋放eIF4E，啟動mRNA的翻譯起始，而未發(fā)生磷酸化的4EBP1與 eIF4E相結(jié)合，抑制eIF4E 與 eIF4G 的結(jié)合［28］。

龐學(xué)燕［23］研究了不同水平亮氨酸對CSN3表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)水平為 118.1～236.2 mg/L時CSN3基因的表達(dá)顯著高于其他組。Arriola等［13］和Appuhamy等［14］研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中單獨添加亮氨酸和必需氨基酸，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中mTOR、S6K1 以及 4 種酪蛋白 CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3的基因表達(dá)量顯著上調(diào)，而與酪蛋白合成相關(guān)的4EBP1基因表達(dá)量也都顯著下調(diào)。此外，Rius等［29］給饑餓處理36 h后的泌乳中期奶牛靜脈灌注氨基酸，發(fā)現(xiàn)乳腺組織中mTOR和S6K1的磷酸化程度顯著提高，而4EBP1的磷酸化顯著降低，同時乳蛋白的合成量也有所提高，這表明mTOR通路能夠調(diào)控乳蛋白產(chǎn)量［6］。這些為進(jìn)一步研究氨基酸對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的機制提供了理論依據(jù)。

本試驗采用實時定量PCR方法檢測添加不同水平的亮氨酸對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中CSN3合成相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明，在缺少亮氨酸的培養(yǎng)基中添加水平范圍為0.112 5～14.400 0 mmol/L(0.2×組～32×組)的亮氨酸，與對照組相比，mTOR、S6K1、4EBP1、JAK2 和 STAT5 基因均顯著上調(diào)表達(dá);除了0.25×組、0.5×組、8×組和16×組CSN3基因的相對表達(dá)量與0×組比較差異均不顯著外，其他各亮氨酸試驗組中CSN3基因表達(dá)量與對照組比較差異顯著。但是不同水平亮氨酸對CSN3合成相關(guān)基因的促進(jìn)效果不同，當(dāng)亮氨酸水平為 0.900 0 mmol/L(2 × 組)時，mTOR、S6K1、JAK2、STAT5和CSN3基因表達(dá)量均達(dá)到最高，而4EBP1基因表達(dá)量最低。這與前人龐雪燕等報道的一致［18，24］。另外，本試驗結(jié)果還表明，對于低水平亮氨酸組(0.25×組～1×組)，隨著亮氨酸水平的增加，各酪蛋白相關(guān)合成基因的相對表達(dá)量隨之升高(4EBP1呈現(xiàn)下降的趨勢);對于高水平亮氨酸組(4×組～32×組)，隨著亮氨酸水平的增加，各酪蛋白合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量隨之降低(4EBP1呈現(xiàn)升高的趨勢)。這說明亮氨酸在調(diào)控CSN3合成相關(guān)基因表達(dá)時存在劑量效應(yīng)和最優(yōu)化效應(yīng);這種效應(yīng)可能是由于亮氨酸需借助相應(yīng)的轉(zhuǎn)運載體進(jìn)入乳腺細(xì)胞內(nèi)繼而發(fā)揮對mTOR通路的調(diào)控作用，而細(xì)胞膜表面的亮氨酸轉(zhuǎn)運載體數(shù)量是有限的，這就從一定程度上限制了亮氨酸調(diào)控作用的不斷提高。

4 結(jié)論

亮氨酸能促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖和CSN3合成相關(guān)基因的表達(dá)。奶牛乳腺上皮細(xì)胞的相對增殖率和CSN3合成相關(guān)基因mTOR、S6K1、JAK2和 STAT5的上調(diào)表達(dá)作用都以0.900 0 mmol/L亮氨酸達(dá)到最強，而此水平下4EBP1的基因表達(dá)量達(dá)到最低。

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