項國劍，張建成，陳 茜，魏國良，魏芝雄，李 泱

2.福建省立醫(yī)院 心內科，福州 350001；

3.解放軍總醫(yī)院 老年心血管病研究所，北京 100853

心臟的正常生理活動由竇房結細胞的自發(fā)性搏動調控，細胞膜上各種離子通道的復雜活動是構成竇房結細胞電生理機制的基礎[1－3]。關于竇房結細胞在心臟起搏活動中離子通道的活動機制是近年來的研究熱點，但目前對于乳鼠竇房結細胞的膜片鉗研究在國內只見于個別學者報道[4]。目前認為，心臟的起搏活動是竇房結的兩種機制共同作用的結果，即“膜鐘（membrane voltage clock）”和“鈣鐘（calcium clock）”[5]。膜鐘主要由起搏電流組成，它可引起竇房結細胞膜電位的變化，引發(fā)電壓依賴性鈣通道開放，使Ca2＋內流，造成細胞內Ca2＋濃度增加，觸發(fā)肌漿網大量釋放Ca2＋，使細胞內Ca2＋瞬間增高稱為鈣瞬變，同時激活鈉鈣交換體（sodium－calcium exchanger，NCX）正向轉運模式（3個 Na＋進入細胞，1個 Ca2＋出 細胞）產 生 NCX 電 流（Na＋／Ca2＋current，INCX）。INCX是起搏電流產生和維持的一個重要組成，其在舒張末期產生內向電流，可引發(fā)動作電位[6]。INCX在竇房結起搏中的作用雖然受到關注，但該電流對竇房結節(jié)律的影響尚不清楚，另外異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）可顯著增加細胞內Ca2＋釋放及鈣火花頻率，激發(fā)竇房結細胞活動，但ISO對NCX活動影響的研究還存在矛盾[7－8]。因此，本研究采用全細胞膜片鉗技術記錄了竇房結細胞自發(fā)性動作電位（action potentials，AP）和INCX，觀察ISO對其影響。

1 材料與方法

1.1 動物 新生24h內Wistar大鼠乳鼠，雌雄不拘，SPF級，[斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2014－0002]。

1.2 試劑 DMEM細胞培養(yǎng)基、PBS磷酸鹽緩沖液（美國Thermo公司）；FBS胎牛血清（美國Invitrogen公司）；胰蛋白酶1∶250、氯化鎳（美國Sigma公司）；HEPES（美國Amresco公司）；鹽酸ISO（美國Sigma公司）。

1.3 鈉 鈣 交 換 體 電 流 的 細 胞 外 液 （mmol／L）：NaCl 140；MgCl21.0；CaCl21.0；KCl 4；HEPES 10；Glucose 5；pH值用NaOH調至7.4。記錄鈉鈣交換體的電極內液（mmol／L）：KCl 130；MgCl21.0；EGTA 5；HEPES 10；Glucose 10；Na2ATP 5。pH值用KOH 調至7.2。

1.4 竇房結細胞急性分離與培養(yǎng) 參照文獻[9]。取乳鼠12只，仰臥位固定四肢，沿胸骨右緣剪開并去除胸前壁，暴露心臟，置于解剖顯微鏡下分離心包膜，輕撥移右心耳，看清上腔靜脈，于界嵴中部靜脈竇側、上腔靜脈根部取約1.0mm×1.0mm×1.0mm的組織塊，立即置于預冷的不含血清的DMEM培養(yǎng)基中，沖洗2次。將所取下的組織塊剪碎成0.2～0.6mm3乳糜狀，加入30～50倍組織塊體積的0.08%胰酶，輕柔吹打0.5min，靜置沉淀后棄上清液，加入同體積的0.08%胰酶，置于37℃水浴中輕輕振蕩3～5min，再次吹打0.5min，沉淀后吸取上清液，用等體積的含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液終止消化，重復消化3～5次至基本消化成單細胞為止。將細胞懸液用400目金屬濾網過濾后，940r／min離心7min，棄上清液。將離心后的細胞用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，接種于培養(yǎng)皿內，后置培養(yǎng)皿于37℃、體積分數為0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)90min，采用差速貼壁技術去除成纖維細胞，分離得到較純化的竇房結細胞，并分裝于培養(yǎng)皿內繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液1次。24h后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并以手按計數器計數細胞收縮頻率。

1.5 膜片鉗形成及參數 將Axon－700B膜片鉗放大器（美國 MDC公司）與計算機連接。應用Digidata 1440A數模轉換器（美國MDC公司）采集刺激信號及電壓輸入信號，此過程均由pCLAMP10.2軟件控制。GG－17玻璃毛坯經pp－83微電極拉制儀（日本NARISHIGE公司）拉制成入液電阻為2.0～5.5MΩ的電極。調節(jié)三維微操縱器進行細胞封接，使封接電阻達1GΩ以上，采用脈沖式負壓抽吸法吸破細胞膜形成全細胞記錄模式。利用全細胞膜片鉗技術記錄方法，在電流鉗模式下記錄AP，在電壓鉗模式下記錄電流。測定細胞膜電容時，施以0.4V／s的 斜 坡 刺 激。電 流 值I以 電 流 密 度（pA／pF）表示以消除細胞間的誤差。信號經截止頻率為1kHz的四階貝塞爾低通濾波器濾波，采樣率為5kHz。為消除膜電容的充放電影響，串聯電阻補償90%～95%以消除電壓偏差，液接電位補償校正至小于2mV，慢電容補償約為85%～90%。細胞膜電容計算方程：

1.6 干擾電流的排除 于細胞外液加入BaCl2200μmol／L阻斷IK1，多非利特（Dofetilide，Dof）5nmol／L阻 斷IKr，CdCl2100μmol／L 阻 斷ICa，L，TTX 100μmol／L阻斷INa。

1.7 統計學處理 數據處理采用pCLAMP 9.2處理，采用Spss 15.0軟件進行統計學處理。數據以±s表示。多組間數據比較用ANOVA方差分析，組間兩兩比較用SNK－q檢驗。以P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 培養(yǎng)細胞生長狀況 分離培養(yǎng)后的竇房結細胞呈大小不等、圓形、清亮的單細胞懸浮于培養(yǎng)液中，4h后開始貼壁生長，后胞體逐漸增大，約17h后可見散在細胞開始搏動，48h后貼壁的搏動細胞逐漸增多，偶見融合成片的細胞進行同步搏動。于倒置顯微鏡下，隨機選取10個視野，觀察鏡下細胞形態(tài)，在分離培養(yǎng)的乳鼠竇房結中可見梭形、三角形、多邊形等3種形態(tài)的細胞，計算各形態(tài)細胞所占比例，再取平均值，即可得到該種形狀細胞所占比例。通過細胞計數發(fā)現，梭形細胞比例最高，達（56.2±3.0）%，三 角 形 及 多 邊 形 細 胞 分 別 為（28.2±3.0）%和（15.6±2.1）%（圖1）。

圖1 乳鼠竇房結分離培養(yǎng)后3種細胞形態(tài)（ ×100）Fig 1 Three cellular types after disassociating and culturing sino－atrial node in newborn rats（ ×100）

2.2 搏動頻率觀察 分別選取梭形細胞、三角形細胞和多邊形細胞各10個觀察搏動頻率，結果發(fā)現，梭形細胞的搏動頻率為（147.9±9.9）min－1，三角形細胞的搏動頻率為（56.5±7.8）min－1，多邊形細胞搏動頻率為（6.3±1.8）min－1。梭形細胞較其他兩形細胞快，差別有統計學意義（P＜0.01，圖2）。

圖2 乳鼠竇房結3種細胞搏動次數Fig 2 The beating rates of three kinds of cells in newborn rats’sino－atrial node.

2.3 自發(fā)性AP及ISO的作用 以ISO用藥前的細胞AP次數為對照組，在電流鉗模式下記錄梭形細胞AP。結果發(fā)現，在無任何電流刺激下，梭形細胞可記錄到自發(fā)性AP；于細胞外加入1.0μmol／L ISO后，細胞AP的發(fā)生頻率明顯增加，從（147.9±9.9）min－1增 加 至 （278±11.2）min－1（圖3）。

2.4 竇房結細胞INCX電流 應用電壓鉗模式研究通道電流密度，鉗制電位為－60mV，預先給予＋80mV，500ms的方波刺激，緊接著以斜坡電壓脈沖從＋80mV以90V／s的速度去極化至－120mV，此后恢復到－60mV，記錄到在去極化電壓下外向電流，而超極化電壓下內向電流，應用5mmol／L NiCl2阻斷該電流[10]，記錄用藥前、后的電流值，并將原始電流減去Ni2＋作用后剩余電流值，即為INCX（圖4）。

圖3 ISO對乳鼠竇房結細胞自發(fā)性動作電位的影響Fig 3 The effect of ISO on spontaneous action potential in newborn rats’sino－atrial node cells.

圖4 乳鼠竇房結細胞INCX電流Fig 4 INCXin newborn rats’sino－atrial node cells

2.5 ISO對INCX電流的作用 以用藥前INCX為空白對照組，于細胞外加入1.0μmol／L ISO。結果顯示，ISO可使＋80mV起始時外向INCX密度從（0.52±0.03）pA／pF增加至（0.72±0.04）pA／pF（n＝10，P＜0.05），平 均 增 加 約 36.7%；而－120mV時內向電流從（－3.26±0.02）pA／pF增加至（－7.81±0.06）pA／pF（n＝10，P＜0.01，圖5）。

2.6 ISO對INCX影響的電壓依賴性和濃度依賴性

將電流密度差值與相應電位作圖，即得INCX電流的I－V曲線。以用藥前INCX為空白對照組相對比，在負于－20mV時，ISO可使INCX內向電流顯著增加，在大于0時，ISO可使INCX外向電流升高明顯（圖6A）。于細胞外液分別加入0.1，0.5，1.0，5.0，10.0μmol／L ISO，將用藥前INCX電流密度作為標準化基線值，將其他ISO不同濃度作用后各電流密度與之比較，取相對值，可見INCX電流隨ISO呈現濃度增加而依賴性升高（圖6B）。

圖5 ISO對乳鼠竇房結細胞INCX電流的影響Fig 5 The increasing effect of ISO on INCXin newborn rats’sino－atrial node cells.

圖6 ISO對INCX影響的電壓和濃度依賴性Fig 6 The voltage－and concentration－dependent fashion of ISO on INCX

3 討 論

近年來，以Ca2＋釋放為特征的“鈣鐘”在竇房結起搏活動中的作用成為研究熱點，國內外有不少關于“膜鐘”和“鈣鐘”的發(fā)生和作用機制的研究證據表明，“膜鐘”（膜上離子通道周期激活和失活引起）和“鈣鐘”（節(jié)律性肌漿網Ca2＋釋放引起）共同參與調節(jié)竇房結的自律性[11]。文獻顯示，在胚胎干細胞分化的心肌細胞中，鈉鈣交換體在起搏活動中起著重要的作用[12]。2009年，Maltsev等在計算機模擬兔竇房結模型中，發(fā)現有鈉鈣交換體電流的參與，能使起搏活動更加穩(wěn)定，且不易誘發(fā)節(jié)律失常或電活動終止[13]。

本實驗發(fā)現，在乳鼠竇房結細胞上存在較大的INCX電流，該電流分為內向和外向二部分，在不同的刺激電壓下其大小不同：在更正的電壓下其外向電流更大，而在更負的電壓下其內向電流增加明顯。該電流的變化將直接影響竇房結細胞的自發(fā)性AP和起搏頻率，這為該電流在心臟起搏活動中的作用提供了實驗依據。2006年，Lakatta等提出INCX是竇房結細胞起搏產生和維持的一個重要組成[14]，其在舒張末期產生內向電流，最終導致膜AP的產生。Lyashkov等研究發(fā)現，NCX在竇房結上的數量分布多于心房及心室肌[15]。Bogdanov等發(fā)現，抑制細胞內鈣釋放將限制心臟起搏細胞的自發(fā)跳動頻率[16]。

目前，對于ISO是否能直接影響鈉鈣交換體活動還沒有定論。有部分研究證實，β腎上腺素可以加強 NCX 的作用[17－18]；另有學者研究發(fā)現，β腎上腺素受體／cAMP通路具有下調NCX的作用[19]。本實驗發(fā)現，在ISO的作用下，INCX內向及外向電流均顯著升高，且此作用呈電壓依賴性及濃度依賴性特征，提示β腎上腺素受體激動可能通過調節(jié)INCX電流的大小，從而影響竇房結的自動去極化過程和起搏頻率，同時ISO可能通過NCX產生正性變時作用。然而，ISO增加INCX電流是否存在頻率依賴性，以及INCX電流是否受頻率的影響還有待進一步研究。

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